[發(fā)明專利]用于快速檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特異性引物及其檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310233134.3
• 申請(qǐng)日: 2013-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN103509856A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔國淑;何書婷;周游;徐文俊;張敏;陳華保;唐貴婷;葉夢萍;彭丹丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 深圳市合道英聯(lián)專利事務(wù)所(普通合伙) 44309
• 代理人: 廉紅果

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及一種植物病原真菌的檢測方法，尤其涉及一種用于快速檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria?dothidea的特異性引物及其檢測方法，用于快速、準(zhǔn)確地對(duì)獼猴桃果實(shí)中是否存在獼猴桃軟腐病原菌進(jìn)行檢測。?

背景技術(shù)

果實(shí)采后腐爛是一個(gè)全球性問題，在世界范圍內(nèi)新鮮水果貯藏過程中有25%～30%以上因腐爛變質(zhì)而不能利用。果實(shí)采后腐爛原因主要是果實(shí)在采后加工、運(yùn)輸、貯存以及銷售過程中，由病原菌侵染所致。隨著我國水果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，種植面積的擴(kuò)大，采后水果腐爛逐步得到重視。但是由于采前病害防治不徹底以及貯運(yùn)技術(shù)的落后，使得采后水果腐爛的情況日益加劇。?

獼猴桃采后貯藏期病害有軟腐病、蒂腐病、青霉病，目前鑒定出的病原菌為：Botryosphaeria?dothidea、Phomopsissp.、Botrytis?cinerea與Penicillium?italicum。這些病菌大多通過傷口侵入果實(shí)，導(dǎo)致貯運(yùn)期間果實(shí)大規(guī)模腐爛，一般發(fā)病率在20%左右，嚴(yán)重時(shí)能達(dá)到50%。其中由于獼猴桃軟腐病在貯藏期傳染速度極快，潛伏期短，危害也最為嚴(yán)重。Cryptosporiopsis、Diaporthe、Cylindrocarpon、Phoma、Botrytis、Alternaria、Mucor和Sclerotinia等屬真菌都曾被報(bào)道與獼猴桃軟腐病相關(guān)，但均未用柯赫氏法則來驗(yàn)證這些真菌是否是獼猴桃軟腐病的病原菌。目前只有Phomopsissp.與Botryosphaeria?dothidea已被證實(shí)是引起獼猴桃軟腐病的病原，但Phomopsissp.只能通過傷口侵染獼猴桃，而B.?dothidea則可直接從果皮侵入到獼猴桃果實(shí)中。由B.?dothidea引起的獼猴桃軟腐病十分普遍，在中國、新西蘭、韓國及日本等國均有報(bào)道。獼猴桃果實(shí)感染軟腐病原菌（B.?dothidea）后，發(fā)病部位初期呈圓形，病斑中央褐色，病健交界處呈暗綠色。病斑表面無凹陷，用手按壓，明顯感覺病部果肉變軟，果實(shí)其他部分組織隨著發(fā)病進(jìn)程迅速變軟。發(fā)病后期病部產(chǎn)生白色菌絲，病部有組織液滲出。剝開皮層可見病部果肉變黃且病健交界處呈水漬狀，中間常有乳白色至淺粉紅色的錐形腐爛。果實(shí)在發(fā)病后7～9?d內(nèi)可導(dǎo)致整個(gè)果實(shí)完全腐爛。?

由于獼猴桃軟腐病發(fā)病快，一旦發(fā)病則極難防治，容易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以，病原的快速鑒定和檢測可為病害的正確診斷和早期防治提供參考。傳統(tǒng)的檢測方法主要依靠菌落形態(tài)，發(fā)病癥狀等方法進(jìn)行，不能快速、準(zhǔn)確地檢測到病原菌的存在，從而導(dǎo)致病害的誤診和防治延誤。雖然利用分子序列比對(duì)來鑒定病原物是一種可靠的方法，但從病原菌的培養(yǎng)到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送出測序以及序列信息返回需要一定周期。這對(duì)于傳染速度快且危害嚴(yán)重的軟腐病來說，需要尋找更加快速準(zhǔn)確的方法。利用種特異性引物檢測病原菌具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)為病害的診斷和早治提供了很多成功的事例。?

Ni?和?Yang?等人于2012年發(fā)表一對(duì)基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（The?ribosomal?internal?transcribed?spacers,?ITS）的Fusicoccum?aesculi（Botryosphaeria?dothidea?的無性態(tài)）特異性引物Bd318F/Bd318R，但是使用NCBI基因庫的BLAST功能驗(yàn)證引物特異性結(jié)果表明，其E?value（代表被比對(duì)的兩個(gè)序列不相關(guān)的可能性，E?value越低，引物特異性越高）高達(dá)28，引物特異性非常低。并且Bd318F/Bd318R引物需要巢式PCR反應(yīng)體系，因此，其便利性差。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria?dothidea的特異性引物及其檢測方法，主要解決現(xiàn)有的技術(shù)手段無法快速、準(zhǔn)確地檢測出獼猴桃中是否存在獼猴桃軟腐病原菌的問題。?

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：?

用于快速檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria?dothidea的特異性引物，包括一組引物BZY-1和BZY-2，其中，BZY-1為正向引物，BZY-2為反向引物，二者的序列分別如下：