[發(fā)明專利]一種固定化核酸酶及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310231034.7
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN104232613B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉國安;徐輝;方芳
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州俊豐生物工程有限公司
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12N11/10;C12N11/08;C12N11/02
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本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種固定化核酸酶及其制備方法。本發(fā)明的固定化核酸酶由核酸酶和固相載體組成，核酸酶通過共價鍵與固相載體上的基團(tuán)相連接。本發(fā)明的固定化核酸酶活性大于500U/g，作用的pH范圍為6～8，最適作用溫度為37℃。本發(fā)明還公開了一種制備固定化核酸酶的方法。本發(fā)明的固定化核酸酶應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品的工藝中，在產(chǎn)品分離純化過程中避免了核酸酶殘留在終產(chǎn)品中，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核酸酶及其制備方法，尤其涉及一種固定化核酸酶及其制備方法。

背景技術(shù)

生物技術(shù)產(chǎn)品在高效表達(dá)時宿主細(xì)胞或菌體也大量增殖，這一過程中往往伴隨著大量的宿主或菌體核酸的擴(kuò)增，在后續(xù)的分離過程中大量的核酸釋放會給目標(biāo)產(chǎn)品的分離純化增加難度，同時部分殘留宿主DNA與產(chǎn)品結(jié)合也很難去除。宿主細(xì)胞的DNA同藥物一起進(jìn)入人體會產(chǎn)生不可預(yù)料的副作用，殘留DNA可能造成機(jī)體DNA的插入突變，導(dǎo)致抑癌基因失活、癌基因被激活等，有可能造成藥物使用者致癌，因此宿主細(xì)胞DNA殘留量是產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一。

許多機(jī)構(gòu)都對重組蛋白類藥物的DNA殘留制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，1984年的國際會議上采納了殘余DNA的臨時限度標(biāo)準(zhǔn)，即來自連續(xù)傳代細(xì)胞系的生物制品每人份劑量DNA殘留不能超過10pg。1986年WHO會議一致認(rèn)為不高于100pg/劑量的細(xì)胞DNA對于非口服途徑的產(chǎn)品，其危險性是可以忽略不計的。1987年，美國FDA建議每人份劑量殘余細(xì)胞DNA的可接受限度為10pg。1997年，美國FDA將生物制品可以允許的殘余DNA限度修改為不超過100pg。歐洲藥典通則中對于殘余DNA的限度規(guī)定為不超過10ng/劑量，但針對個別疫苗(如甲型肝炎滅活疫苗殘余DNA應(yīng)不超過100pg/劑量；乙型肝炎疫苗DNA殘留量應(yīng)不超過10pg/劑量)會有所不同。

1990年2月，衛(wèi)生部頒布的《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點(diǎn)》3.3.1.6條款規(guī)定，必須用敏感的方法測定來源于宿主細(xì)胞的殘余DNA含量，這對于用哺乳動物傳代細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系)生產(chǎn)的制品尤為重要。一般認(rèn)為殘余DNA含量小于100pg/劑量是安全的。《中國藥典》三部(2005年版)對CHO細(xì)胞表達(dá)的重組乙型肝炎疫苗提出CHO細(xì)胞殘余DNA含量不高于10pg/劑量。近幾年，我國采用Vero細(xì)胞生產(chǎn)滅活疫苗逐漸增多，疫苗的種類包括人用狂犬病純化疫苗、腎綜合征出血熱純化疫苗、甲型肝炎滅活疫苗、乙型腦炎純化疫苗。《中國藥典》(2005年版三部)及(2010年版三部)對于Vero細(xì)胞培養(yǎng)疫苗一般要求殘余外源DNA不超過100pg/劑量。

非特異性核酸內(nèi)切酶是一類高活性的水解酶，其最大特點(diǎn)是能非特異性地降解幾乎所有形式的核酸。來自粘質(zhì)沙雷氏菌非特異性核酸內(nèi)切酶(Serratia marcescens non-specific endonuclease，SMNE，E.C.3.1.30.2)是其中的典型代表，該酶能降解各種形式核酸的核酸內(nèi)切酶，包括單鏈，雙鏈，線性和環(huán)狀DNA和RNA以及基因組DNA，對核酸的序列沒有嚴(yán)格要求，并且沒有蛋白酶活性。該酶在廣泛條件范圍具有很高的核酸降解活性，能將核酸完全消化成雜交限度以下的2-5個堿基長度的5’-單磷酸寡核苷酸。

該酶由分子量為30kDa的兩個亞基組成，作用的pH范圍為6～10，溫度0～42℃，酶發(fā)揮活性需要1～2mM Mg2+。在離子型及非離子型表面活性劑和1mM PMSF，1mM EDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150mM的單價陽離子，大于100mM的磷酸根，大于100mM硫酸銨和大于100mM鹽酸胍抑制酶的活性。

核酸酶具有廣闊的應(yīng)用前景，適合從生物制品中去除核酸，其主要應(yīng)用于以下幾個方面：

1、提高產(chǎn)品質(zhì)量：核酸酶通過降低生物制品，尤其是病毒類產(chǎn)品外源性核酸的含量，減少過敏反應(yīng)，提高制品安全性；

2、改善重組蛋白工藝：工程細(xì)胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，縮短處理時間，提高蛋白產(chǎn)量，離心時有利于沉淀和上清液的分離，超濾時有利于各成分的分離，提高柱層析純化時的有效性；