[發(fā)明專利]輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的引物組合物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310230937.3
• 申請(qǐng)日: 2013-06-09
• 公開（公告）號(hào): CN104232624B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蒲娟;劉金華;魏延迪;俞晨芳;裴星瑤;齊魯;張谞霄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的引物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

H9亞型禽流感和雞傳染性支氣管炎是目前危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病。H9亞型禽流感病毒可以感染多種禽和哺乳動(dòng)物，并可導(dǎo)致禽類發(fā)病死亡，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的健康發(fā)展。雞傳染性支氣管炎也是一種危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病，病雞主要表現(xiàn)呼吸道癥狀。臨床上兩病癥狀相似，兩種病毒感染均導(dǎo)致肉雞生長緩慢和蛋雞產(chǎn)蛋率下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒抗原特性的變異，導(dǎo)致常規(guī)血清學(xué)方法無法檢出流行毒株。因此，建立一種快速有效的鑒別兩種病毒流行毒株的診斷方法，對(duì)于及時(shí)采取有效控制措施和防止疫情擴(kuò)散具有重要的意義。

對(duì)于傳統(tǒng)的檢測方法，如病毒分離、氣管環(huán)培養(yǎng)試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶試驗(yàn)等，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不能做出快速而及時(shí)的診斷；而且不能在同一檢測反應(yīng)中檢測不同的對(duì)象，即無法同時(shí)進(jìn)行鑒別診斷。由于變異株的出現(xiàn)，常常導(dǎo)致這些方法無法檢出病毒，出現(xiàn)漏檢的情況。因此，建立一種能夠快速鑒別診斷H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒，而且很好的覆蓋當(dāng)前流行毒株的檢測方法非常重要。

傳統(tǒng)的流感病毒檢測方法為采用雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)（需時(shí)2-3天），然后采用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行流感病毒亞型的鑒定（需時(shí)1天）。雞傳染性支氣管炎病毒檢測方法通常采用雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)或者氣管環(huán)組織培養(yǎng)這種傳統(tǒng)的檢測方法，其中利用雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)需要10天時(shí)間，而氣管環(huán)組織培養(yǎng)技術(shù)難度比較大，操作不易。總之，傳統(tǒng)的檢測方法具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的弊端，難以做出快速而及時(shí)的診斷；而且不能在同一檢測反應(yīng)中檢測不同的對(duì)象，即無法同時(shí)進(jìn)行鑒別診斷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的引物組合物及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的特異引物對(duì)，由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA分子組成。

本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對(duì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下（a）或（b）：（a）輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒；（b）輔助鑒定待測樣本中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒。所述待測樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織（肝、腦、肺等）或雞的內(nèi)臟組織（肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括所述特異引物對(duì)；所述試劑盒的用途為如下（a）或（b）：（a）輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒；（b）輔助鑒定待測樣本中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒。所述待測樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織（肝、腦、肺等）或雞的內(nèi)臟組織（肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：以待測病毒的cDNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測病毒為候選的雞傳染性支氣管炎病毒，如果沒有得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測病毒為候選的非雞傳染性支氣管炎病毒。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為600-700bp,具體可為655bp。所述待測病毒可為H9N2亞型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、H4N6亞型禽流感病毒、H3N8亞型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒或新城疫病毒。所述方法為非疾病治療和診斷方法。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測樣本中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：以待測樣本的cDNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測樣本疑似含有雞傳染性支氣管炎病毒，如果沒有得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測樣本疑似不含有雞傳染性支氣管炎病毒。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為600-700bp,具體可為655bp。所述待測樣本可為死亡的雞的肝、腦、肺等組織，也可為死亡的雞的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織（肝、腦、肺等）或雞的內(nèi)臟組織（肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。所述方法為非疾病治療和診斷方法。

本發(fā)明還保護(hù)一種引物組合物，由引物對(duì)甲和引物對(duì)乙組成；所述引物對(duì)甲由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)乙由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA分子組成。