[發明專利]一種獲得微環DNA的親本質粒及其應用

有效

• 申請號: 201310229687.1
• 申請日: 2013-06-09
• 公開（公告）號: CN104232676B
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 馬晴雯;劉瀏;曾凡一
• 申請（專利權）人: 上海市兒童醫院;上海滔滔轉基因工程股份有限公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N1/21;A61K48/00;C12R1/19
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種獲得微環DNA的親本質粒，其特征在于，所述親本質粒是在真核表達載體pEGFP-N1-attB質粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表達盒構建而成，其中所述attR片段插入pEGFP-N1-attB質粒的限制性內切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位點之間，所述attL片段插入pEGFP-N1-attB質粒的限制性內切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位點之間，所述ΦC31整合酶基因表達盒插入pEGFP-N1-attB質粒的限制性內切酶AflⅢ的酶切位點。

2.如權利要求1所述獲得微環DNA的親本質粒，其特征在于，所述attR片段為λ噬菌體attR片段，所述attL片段為λ噬菌體attL片段。

3.如權利要求1所述獲得微環DNA的親本質粒，其特征在于，所述ΦC31整合酶基因表達盒中的啟動子片段為PGK啟動子片段。

4.一種包含如權利要求1～3任一項所述獲得微環DNA的親本質粒的重組表達轉化體。

5.一種轉基因方法，其特征在于，所述轉基因方法包括以下步驟：

（1）在權利要求1～3任一項所述獲得微環DNA的親本質粒的多克隆位點中插入外源基因；

（2）將步驟（1）所得的獲得微環DNA的親本質粒中加入LR克隆酶進行LR重組反應，得到包含微環DNA和表達ΦC31整合酶的微質粒的LR重組體系，所述LR重組反應的條件為：20～30℃，反應3～14小時；

（3）利用所得LR重組體系轉染宿主細胞。

6.如權利要求5所述的轉基因方法，其特征在于，步驟（2）所述LR重組體系中微環DNA與表達ΦC31整合酶的質粒的摩爾比為1:1～1:100。

7.如權利要求5所述的轉基因方法，其特征在于，步驟（3）所述宿主細胞為真核細胞。

8.如權利要求1～3任一項所述獲得微環DNA的親本質粒在制備轉基因載體中的應用。

9.如權利要求1～3任一項所述獲得微環DNA的親本質粒在制備基因治療藥物中的應用。