[發明專利]一種從赭色小莫勒菌中提取藿烯的方法

有效

• 申請號: 201310229308.9
• 申請日: 2013-06-09
• 公開（公告）號: CN103276041A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 邱君志;何肖云;郭慶豐;曹麗萍;張以盼;孟麗雪;李小霞;涂潔;董冬;姚靈丹
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;A61P35/00
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種從赭色小莫勒菌中提取藿烯的方法。

背景技術

赭色小莫勒菌(Moelleriellaochracea)系蟲生真菌的重要成員，其代謝物在生物防治與醫用等方面都展現了巨大的開發潛力：①莫勒菌能引起粉虱和介殼類昆蟲群體性流行病的發生，這使得它能成為有效的生物防治劑；②其代謝產物具有較好的抗菌、殺瘧原蟲活性，并對昆蟲細胞和腫瘤細胞有較強的毒性，對哺乳動物細胞卻幾乎無毒。

在現今社會，人們愈加重視療效，特別是對于癌癥等重大疾病的治療。因而尋找不同來源的有效抗癌藥物早已備受關注。蟲生真菌的代謝物中含有多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇等多種殺蟲、抗腫瘤、抗炎、抗菌的物質。因此，對蟲生真菌的充分開發利用，將有利于人類醫療水平的發展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從赭色小莫勒菌中提取藿烯的方法，以促進其藥理學的研究和作為先導化合物的開發和應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

從赭色小莫勒菌中提取藿烯的方法包括以下步驟：

1）將赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中國的發現.?菌物學報，2009.28(1):?148-150）活化后，取菌塊接種PDB培養基中，在160r/min、25℃條件下連續培養8天即初級培養，按10％接種量再次轉接到PDB培養基中，繼續在160r/min、25℃條件下連續培養28天即次級培養。

2）減壓抽濾得到菌絲體，菌絲體在40℃下恒溫干燥后研磨成粉狀，過篩，用乙酸乙酯浸泡，超聲，重復3次。合并浸泡液，旋蒸得菌絲體浸膏。

3）將菌絲體浸膏上200~300目硅膠柱，以石油醚和丙酮梯度洗脫，收集石油醚：丙酮體積比=20:1部分洗脫液，旋蒸濃縮，氯仿洗出，自然揮干，再由甲醇重結晶，經HREIMS、NMR譜圖分析得到藿烯。

4）使用MTT法進行細胞活性的測定。

所述PDB培養基的制備為：馬鈴薯去皮，切塊，稱取200g，沸水煮30min，?6層紗布過濾，稱取20g葡萄糖，加蒸餾水定容至1000mL，pH自然。高壓滅菌121℃，20min。

所述步驟1）中接種菌塊的大小為0.5×0.5cm，接種量為4塊。

所述步驟2）中要用3倍體積乙酸乙酯浸泡24h，超聲1h。

所述步驟3）中重結晶具體操作為：用氯仿將得到的含有少量雜質的藿烯溶解，自然揮干，待晶體析出后，再用甲醇洗去雜質，析出棄掉，剩余的晶體再用甲醇溶解后重結晶，直至獲得單一的藿烯。

本發明的顯著優點在于：本發明以繁殖快、周期短的真菌為材料，成本低，操作簡單，重復性好，通過簡單的方式即可制得較純的物質。根據細胞活性測定所得到的數據可以說明該種化合物有優異的抗腫瘤活性。

附圖說明

圖1是藿烯的薄層層析TLC。濃硫酸顯色為紅色，則說明其為三萜類物質。

圖2是藿烯的¹H?NMR譜。圖中表明存在7個甲基信號，其中6個連在季碳上，另外一個連在季碳雙鍵上。

圖3是藿烯的¹³C?NMR譜。由圖可知其中存在有30個碳信號，且其中2個為雙鍵碳原子，說明存在乙烯基團。

圖4是藿烯的¹³C?NMR譜(下)和DEPT?135譜(上)。將兩圖進行對比后發現，其中含有6個季碳，12個仲碳。

圖5是藿烯的EI-MS譜。根據圖中所給出的m/z為410，可推測其相對分子質量為410。

圖6是藿烯的化學結構。

具體實施方式

實施例1

藿烯的制備

1）將赭色小莫勒菌（本實驗室野外采集，分離純化并保藏菌株）活化后，以0.5×0.5cm（4塊）接種于?PDB培養基（馬鈴薯去皮，切塊，稱取200g，沸水煮30min，?6層紗布過濾，稱取20g葡萄糖，加蒸餾水定容至1000mL，pH自然。分裝到250ml三角瓶中，每瓶裝100ml，高壓滅菌121℃,20min，在160r/min、25℃條件下連續培養8天即初級培養，按10％接種量再次轉接到PDB培養基中，繼續在160r/min、25℃條件下連續培養28天即次級培養；

2）減壓抽濾得到菌絲體，菌絲體在40℃下恒溫干燥后研磨成粉狀，過篩，用3倍乙酸乙酯浸泡，超聲，重復3次。合并浸泡液，旋蒸得菌絲體浸膏。?