[發明專利]重組DNA序列、酵母菌、乙肝表面抗原制備方法及疫苗

在審

• 申請號: 201310229177.4
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN104232661A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 李津;許毅;張德有;楊云凱;王曦;馬銳
• 申請（專利權）人: 北京天壇生物制品股份有限公司
• 主分類號: C12N15/51
• 分類號: C12N15/51;C12N1/19;C12P21/02;A61K39/29;A61P31/20;C12R1/93;C12R1/78
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業平;張天舒

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地講，本發明涉及一種adr亞型乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重組DNA序列及其應用。

背景技術

中國屬于乙型肝炎高發地區，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的攜帶率達10％左右。目前控制乙型肝炎的方法主要依靠預防，乙型肝炎疫苗是預防乙型肝炎的最有效武器。通過從乙肝病人的血液中分離純化HBsAg亞病毒顆粒，研制成功了第一代血源多肽乙型肝炎疫苗。后來應用最簡單的真核細胞-釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)作為受體細胞，人們又成功地構建了DNA重組HBsAg工程菌株，它表達的HBsAg在酵母細胞的內質網上組裝成為亞病毒顆粒，從而成為研制第二代基因重組多肽乙型肝炎疫苗的原料。

目前在生產重組HBsAg時，大多采用的是釀酒酵母工程菌。有關使用釀酒酵母生產重組HBsAg的工藝和方法可參見美國專利US5,013,650、美國專利US6,232,111、韓國專利KR9014361、中國專利申請公開CN1552857A、中國專利申請公開CN1552893A等。但是這一表達系統在應用過程中也存在諸多不足之處，如外源基因表達水平不高、表達蛋白的分泌水平低、多肽鏈糖基化過度、菌株不穩定等。

而其它的酵母菌株，尤其是甲醇營養型酵母在外源基因的表達上則顯示出更大的優勢，這其中的多形漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)是目前國際上公認的最為理想的外源基因表達系統之一，適于大規模工業化生產外源蛋白。多形漢遜酵母的技術優勢和產業化應用價值可歸納為：①多形漢遜酵母的外源基因整合于細胞染色體中，重組菌株有絲分裂遺傳穩定性高；②可利用甲醇氧化酶基因(MOX)和甲醛脫氫酶基因(FMD)等強啟動子，高效地啟動外源基因的表達；③具有自主復制序列(HARS)，重組的頻率高，重組質粒可以高拷貝整合到染色體上，易獲得高拷貝整合的轉化子；④蛋白的表達可在過氧化物酶體內進行，可使其免受細胞內蛋白酶的降解，并降低了對細胞的毒害作用；⑤能利用廉價的化學合成培養基進行細胞高密度發酵，不需要添加價格昂貴的天然組分，進一步降低了生產成本并提高了外源基因的表達水平；⑥耐高溫，最適生長溫度為37-43℃，生長速率快，大規模發酵的培養時間短：⑦發酵中以甘油或甲醇為唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多，能利用甲醇的微生物更少，發酵染菌率低；⑧外源蛋白的表達量和分泌效率比釀酒酵母高10倍左右，且沒有過度糖基化現象，因此適合于大規模發酵生產目的蛋白。

德國萊茵公司最早使用漢遜酵母表達adw亞型HBsAg并于1995年開發成功重組漢遜酵母乙肝疫苗，1997年韓國綠十字公司從德國萊茵公司引進相關技術，用漢遜酵母表達adw亞型HBsAg制備乙肝疫苗。印度血清研究所亦用重組漢遜酵母表達的adw亞型HBsAg生產乙肝疫苗。國內已有報道用誘變缺陷型漢遜酵母菌重組構建表達adw亞型HBsAg制備乙肝疫苗。歐美和印度所制重組乙型肝炎疫苗多為adw亞型，國內外未見用漢遜酵母表達adr生產乙型肝炎疫苗的報道。