[發明專利]一種生產7-脫氫膽甾醇的釀酒酵母菌株及構建方法

無效

• 申請號: 201310229154.3
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103275997A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 元英進;張瑩;張璐;劉奪;周曉
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種生產7-脫氫膽甾醇的釀酒酵母菌株及構建方法。

背景技術

7-脫氫膽甾醇(7-DHC)不僅是維生素D₃的重要前體，也是制備膽甾相液晶材料的原料，在生物醫學、電磁場檢測、顯示等方面均有著廣泛的應用。7-脫氫膽甾醇消耗量巨大，但其來源和產量問題無法滿足當前日益增長的需求。現有的7-脫氫膽甾醇制備方法，主要是化學合成法——溴化/脫溴化氫法和氧化還原消除法。但由于化學法工藝流程長，反應步驟多，收率低，副產物去除過程復雜，能耗高且易對環境造成嚴重污染，極大限制了7-脫氫膽甾醇的生產和應用。

目前，生物法合成7-DHC主要以酶促反應為主。Donald?Lewis以角鯊烯為底物，加入動物肝臟提取微粒酶，在37℃恒溫水浴搖床催化反應，并在反應體系中加入7-DHC還原酶(DHCR7)抑制劑以阻斷DHCR7的還原反應，可獲得積累較多的7-DHC。其他研究者以膽固醇為底物，利用形成脫皮激素動物的細胞色素P450中的7、8-脫氫酶，將膽固醇C7、8位之間的雙鍵脫去形成7-DHC，該方法的優點是底物膽固醇相對于角鯊烯成本低，來源方便，且是一步反應，能大大提高轉化效率。Christine?Lang于2006年公開了酵母中生產7-DHC的方法。通過表達來自小鼠和人的C-8甾醇異構酶、C-5甾醇去飽和酶和甾醇C24-還原酶的基因，并將ERG5和ERG6失活且tHMG1基因被過表達，獲得了能合成7-DHC的酵母菌。荷蘭的Hohmann?Hans-Peter等人也通過上調HMG1的截短基因，失活ERG5和ERG6，并引入脊椎動物來源的固醇C-24還原酶，實現了在酵母中生產7-DHC，該技術于2012年在我國公開。

合成生物學的出現，在合成重要產品、生產清潔能源、維護人類健康等方面均取得了令人矚目的成果，引起極大關注。利用合成生物技術構建7-脫氫膽甾醇的合成功能模塊，微調模塊與釀酒酵母底盤細胞的關系，實現7-脫氫膽甾醇的人工合成，不僅可以彌補化學法的缺陷，且生產過程綠色清潔，具有很大的優勢和廣闊的市場前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種固醇C-24還原酶基因。

本發明的第二個目的是提供一種固醇C-24還原酶基因編碼的蛋白質。

本發明的第三個目的是提供一種包含固醇C-24還原酶基因的生產7-脫氫膽甾醇的釀酒酵母菌株的構建方法。

本發明的第四個目的是提供一種生產7-脫氫膽甾醇的釀酒酵母菌株。

本發明的技術方案概述如下：

一種固醇C-24還原酶基因，它是序列表SEQ?ID?NO:9所述的核苷酸序列。

上述一種固醇C-24還原酶基因編碼的蛋白質，所述蛋白質是序列表SEQ?ID?NO:10所述的氨基酸序列。

一種包含固醇C-24還原酶基因的生產7-脫氫膽甾醇的釀酒酵母菌株的構建方法，包括如下步驟：

(1)載體的構建

載體SyBE_000923的構建：

①將酵母組成型啟動子、tHMGR基因、終止子應用限制性內切酶方法拼接起來，得到兩端包含XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點的片段，連接至整合型載體pRS403、pRS405、pRS304或pRS305中；

②將酵母組成型啟動子、ERG1基因、終止子應用限制性內切酶方法拼接起來，得到兩端包含ApaⅠ和SalⅠ兩個位點的片段，連接至步驟①獲得的載體，得到載體SyBE_000923；

所述tHMGR基因是序列表SEQ?ID?NO:3所述的核苷酸序列；所述ERG1基因是序列表SEQ?ID?NO:7所述的核苷酸序列；

載體SyBE_000937的構建：

將酵母組成型啟動子、SEQ?ID?NO:9所示固醇C-24還原酶基因、終止子采用限制性內切酶方法拼接起來，得到兩端包含HindⅢ和BamHⅠ位點的片段，連接入游離型載體pYES2、pRS423或pRS425中，得到載體SyBE_000937；

(2)酵母菌株SyBE_000954的獲得