[發明專利]一種阻斷白斑綜合癥病毒感染對蝦的口服劑及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201310228428.7
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103272229A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 施定基;賈曉會;張春莉;王偼;何培民;賈睿;侯李君;張楠;彭國宏;鄧元告;蔡春爾
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;A61P37/04;C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發明涉及生物技術和漁業養殖領域，具體為一種用藍藻制備的防治對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的漁藥。特別是涉及一種用轉基因藍藻制備的、可阻斷WSSV感染對蝦疫苗或免疫促進物的口服劑。

背景技術

白斑綜合癥病毒（White?Spot?Syndrome?Virus，簡稱WSSV）在病毒中屬于Nimaviridae科Whispovirus屬，呈桿狀，含環狀雙螺旋DNA基因組292,967bp。它能感染近百種無脊椎動物，主要是蝦（40種）和蟹（42種）。從1992年在臺灣北部發現以來，10年內WSSV就成全球所有的主要養蝦場最大的殺手。1994年我國大陸沿海各養蝦場感染后，年產量從21.95萬噸急劇下降到5.5萬噸，減產74.8%。20年來，各國從換養殖品種、篩無毒蝦苗、改養殖管理等方面作努力，已恢復并發展了養蝦業。然而，尚未見國內外已報導過在生產規模中應用了有效防治的藥物。我國近年WSSV的感染率仍為35-50%，死亡率為60-80%。在感染對蝦的20種病毒中，死亡率仍居首位。WSSV已在全球造成了70多億美元的經濟損失。

防治病毒病在人類和脊椎動物中用疫苗在200年前已見效。至今，能發生專一性（或適應性）免疫反應的疫苗，仍是防治病毒病最有效的藥物。無脊椎動物中過去認為只有先天的、非專一性的免疫響應，近10年來已證明，對蝦存在后天適應的、專一的免疫響應。用注射、浸泡和口服三種方法用WSSV有關蛋白處理對蝦，都能降低對蝦的感染率和死亡率，但程度不同。注射法效果最好，只是生產規模中無法用；浸泡法操作簡易，但效果最差，成本最高；口服法效果較好，但成本也高。這主要是，至今抗原蛋白（如VP28）多用轉基因細菌制備，需純化后才能使用。

誘導對蝦的專一性免疫能力，通常用WSSV的結構蛋白，已從這病毒鑒定出38種結構蛋白。病毒感染對蝦涉及多個結構蛋白，其中獲得最高成活率的對蝦是用VP28和蛋白激酶的dsRNA處理的；完全抑制WSSV感染的是連續3次注射VP28的短干擾RNA（siRNA）。

上述注射、浸泡和口服的方法均存在缺陷，限制了大規模使用或者成本過高。本發明選擇VP28的編碼基因（GenBank中的編號為DQ681069.1）作為目的基因構建合適的載體，轉化藍藻。把目的基因轉入藍藻表達抗原蛋白，藍藻中的無毒種類可作為蝦苗的餌料，食藥同源，不需純化。

發明內容

本發明的目的是提供一種用轉基因藍藻制備的防治對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的口服劑漁藥。

本發明還提供了上述口服劑的制備方法和應用。

一種阻斷白斑綜合癥病毒感染對蝦的口服劑，其成分包括含有白斑綜合癥病毒VP28基因的轉基因藍藻，劑型為粉劑、顆粒劑、膠囊、片劑或丸劑；優選的，所述藍藻為念珠藻或聚球藻。

這種口服劑可用于制備防治對蝦白斑綜合癥病毒的口服疫苗或免疫促進劑，可用于防治對蝦白斑綜合癥病毒，尤其用于在仔蝦期防治對蝦白斑綜合癥病毒。

上述口服劑的制備方法步驟包括：

（1）將對蝦白斑綜合癥病毒的VP28基因轉入藍藻，獲得轉基因藍藻，轉基因藍藻的構建方法包括以下步驟：

a.釣出目的基因：以對蝦白斑綜合癥病毒的基因組DNA為模板，用PCR法擴增獲得VP28基因；依據VP28的氨基酸序列，設計和合成引物；純培養WSSV并提取其DNA作模板；用上述引物和模板通過PCR技術釣出VP28的編碼基因并測序鑒定；VP28基因在GenBank中的編號為DQ681069.1；

b.構建載體：VP28基因與pRL-489質粒連接，構建穿梭表達載體并轉入大腸桿菌；即選用在藍藻和大腸桿菌中都可擴增和表達的質粒，轉化大腸桿菌，培養時擴增質粒，提取后，與PCR法釣出的VP28基因連接，構建成轉化藍藻的穿梭表達載體；

c.將含有輔助質粒和結合質粒的大腸桿菌、步驟b獲得的帶有穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻培養到對數生長中期，按照4.5～5.5：4.5～5.5：1的細胞數量比混合，通過三親接合轉移法用帶VP28基因的載體轉化藍藻；

選用絲狀體的念珠藻（Nostoc）和單細胞的聚球藻（Synechococcus）作為宿主系統已證明，它們可被外源基因轉化；轉化前把這些藻接種在液體BG-11培養液中，在光照振蕩培養箱中，生長到對數生長期，純化后保存在低溫或固相上；用三親接合法把上述載體轉入藍藻細胞中；