[發明專利]溶酪大球菌及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310227807.4
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103451123A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 劉芳;徐為民;諸永志;王道營;耿志明;張牧焓;卞歡
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/00
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所 32106
• 代理人: 江平

技術領域

本發明屬于微生物領域，具體涉及一株溶酪大球菌，以及溶酪大球菌的制備方法和應用技術。?

背景技術

腐胺（putrescine）是一種有機化合物，常溫下為無色晶體或無色至微黃色液體。腐胺的分子式為NH₂(CH₂)₄NH₂，也被命名為1，4-丁二胺、1，4-二氨基丁烷、四亞甲基二胺或腐肉堿。腐胺是工業上生產尼龍-46、尼龍-6及尼龍-66的原料，尤其是尼龍-46廣泛用于汽車、摩托的零部件材料，而尼龍-66是電子產品的生產原料，酸性氣體吸收劑。目前腐胺的制備方法主要有（1）由氰化氫與丙烯腈反應生成的丁二腈氫化而進行規模化生產；（2）在碳酸鈉的作用下，由吡咯與鹽酸羥胺反應得到丁二肟，再在鈉汞齊作用下，經無水乙醇加熱還原制備；（3）由2，5-二氨基戊酸加熱催化脫羧制備；（4）以精氨酸脫羧、脫胍制備。由此可見，目前腐胺的生產方式主要以化學合成為主，能量消耗大，對環境也有污染。我國腐胺需求量較大，但國內企業生產能力和產品質量有限，從國外進口價格也很高，因此需要尋求高純度腐胺的制備方法，以降低生產成本，減少對環境的污染。?

發明內容

本發明的目的是提供溶酪大球菌，并通過該菌的代謝特性發酵生產腐胺，獲得高濃度的腐胺發酵液。?

本發明溶酪大球T17菌于2013年5月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為：CGMCC?No.7623，分類命名：溶酪大球菌?Macrococcus?caseolyticus。?

本發明另一目的是提供以上溶酪大球T17的篩選方法。?

本發明采用普通營養肉湯瓊脂從市售制熟的鹽水鴨產品中分離得到。?

在普通營養瓊脂培養基37℃中菌落是乳白色，隆起，革蘭氏染色陽性，普通顯微鏡下是球狀。?

本發明容易分離提取，可以降低生產成本，減少化學合成造成的環境污染，使用該微生物發酵生產腐胺，發酵液中腐胺含量較高。?

本發明再一目的是提出以上溶酪大球T17在生產高濃度腐胺方面的應用。?

本發明是以溶酪大球菌T17為生產菌株，接種保存好的純菌接種至普通營養肉湯液體培養基中，待菌株生長到對數生長期（OD值為0.6左右）；將該活化好的菌液按照1%的接種量接種到改良的普通營養肉湯培養基中，37℃220rpm振蕩培養4-6天；將培養后的菌體發酵液10000rpm離心5min，此時的上清液即含有高濃度的腐胺，腐胺的含量在每升發酵液500mg以上。?

本發明直接以鳥氨酸為前體，通過一些特定的具有鳥氨酸脫羧酶活性的微生物的作用，可以獲得高濃度的腐胺，然后從發酵液上清中分離腐胺，可以減少化學合成的污染，降低生產成本。由于本發明溶酪大球菌是從食品中分離獲得，并且也是傳統發酵肉制品中的一種菌，因此從該類菌中篩選到能產腐胺的菌株T17，該類菌不攜帶致病基因，發酵后的菌體也容易滅菌處理，使用該菌來發酵生產腐胺會比別的微生物發酵更為安全，不會造成有毒微生物和致病基因危害。?

本發明所述的改良普通營養肉湯培養基的成分是在普通營養肉湯培養基中添加質量百分比分別占1%和0.005%的L-鳥氨酸、磷酸吡哆醛。?

附圖說明

圖1為七種生物胺標樣的分離效果圖?

圖2為以鳥氨酸為底物時，溶酪大球菌T17（CGMCC?No.7623）的發酵上清液的高效液相圖。

圖3為溶酪大球菌T17的鳥氨酸脫羧酶基因序列和氨基酸序列。?

具體實施方式

一、溶酪大球菌T17的篩選和鑒定：?

1、準確稱取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的標準品各50mg，用0.4mol/L的高氯酸（HClO₄）定容到50mL，配成1mg/mL儲備液備用。

分別取以上標準品儲備液，用0.4mol/L?HClO₄配制成質量濃度分別為2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的混合標準溶液，鋁箔避光、4℃冰箱保存備用。?

2、無菌條件下從每只制熟的鹽水鴨中分別取5g鴨脖和鴨翅肉、15g鴨胸肉、10g鴨腿肉及10g鴨背肉，共40克混合搗碎，每只鹽水鴨的鴨肉作為一個試驗樣品。?