[發明專利]腸道病毒71基因修飾系統的建立及其應用

有效

• 申請號: 201310227097.5
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN103305475A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 常國輝;劉京梅;孫走南;楊益;蘇文莉;唐玥;何湘
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/863;C07K14/085;C12N15/41;A61K39/125;A61K48/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.腸道病毒71型突變株，是將野生型腸道病毒71型基因組RNA中編碼2C蛋白的第25位氨基酸Ile的密碼子替換為編碼Val的密碼子后得到的重組病毒。

2.根據權利要求1所述的腸道病毒71型突變株，其特征在于：所述野生型腸道病毒71型為腸道病毒71型安徽分離株1。

3.根據權利要求1或2所述的腸道病毒71型突變株，其特征在于：所述腸道病毒71型突變株的基因組RNA反轉錄的cDNA序列為序列表中序列2的第45-7439位。

4.制備權利要求1-3中任一所述腸道病毒71型突變株的方法，包括如下步驟：

（a）將在野生型痘苗病毒基因組DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位點位于序列1中；

（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1細胞后，用步驟（a）獲得的重組質粒甲轉染所述CV-1細胞，所述野生型痘苗病毒與所述重組質粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位點處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙；

（c）將步驟（a）中的所述重組質粒甲中的所述gpt基因替換為核苷酸片段A，得到重組質粒乙；所述核苷酸片段A為含有權利要求1-3中任一所述腸道病毒71型突變株的基因組RNA反轉錄的cDNA序列的核苷酸片段，

（d）用步驟（b）得到的重組痘苗病毒載體乙感染新的CV-1細胞后，用步驟（c）獲得的重組質粒乙轉染所述新的CV-1細胞，所述重組痘苗病毒載體乙與所述重組質粒乙通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述核苷酸片段A替代所述重組痘苗病毒載體乙中所述gpt基因的重組痘苗病毒載體丙；

（e）提取步驟（d）得到的重組痘苗病毒載體丙的基因組DNA，通過體外轉錄，獲得所述重組痘苗病毒載體丙的基因組的全長RNA；將所述全長RNA轉染BHK-21細胞，培養轉染后的細胞，獲得所述腸道病毒71型突變株。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述野生型痘苗病毒為野生型痘苗病毒WR株。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法的步驟（a）中，位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別為GenBank號為NC_006998.1的序列的第80267-80725位和第80726-81194位；或

在所述核苷酸片段A中，在所述腸道病毒71型突變株的基因組RNA反轉錄的cDNA序列前，含有T7啟動子相關序列；

所述T7啟動子相關序列具體為序列表中序列2的第10-44位；

所述核苷酸片段A的序列具體為序列表中序列2的第10-7496位。

7.蛋白質，其氨基酸如序列表中序列3所示。

8.編碼權利要求7所述蛋白質的核酸分子；

所述核酸分子具體為如下1）-3）中任一DNA分子：

1）編碼序列為序列表中序列2的第787-7368位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2的第10-7496位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2所示的DNA分子。

9.權利要求1-8中任一所述腸道病毒71型突變株或所述蛋白質或所述核酸分子在制備抗病毒疫苗中的應用；

所述抗病毒疫苗具體為抗腸道病毒疫苗；

所述抗腸道病毒疫苗具體為抗腸道病毒71型疫苗。

10.如下（b1）-（b3）任一中的生物材料：

（b1）含有權利要求1-8中任一所述腸道病毒71型突變株或所述蛋白質或所述核酸分子的離體動物細胞或重組菌；

（b2）含有權利要求1-6中任一所述腸道病毒71型突變株的基因組RNA或cDNA的載體；

（b3）活性成分為權利要求1-8中任一所述腸道病毒71型突變株或所述蛋白質或所述核酸分子的抗病毒疫苗。