[發明專利]腸道病毒71型的活體成像示蹤系統及其應用

有效

• 申請號: 201310226287.5
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN103305476A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 劉京梅;常國輝;孫走南;楊益;蘇文莉;唐玥;何湘
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/63;A01K67/027;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種腸道病毒71型的活體成像示蹤系統及其應用，特別涉及一種在野生型腸道病毒71型安徽分離株1基因組中插入Gaussia熒光素酶基因后得到的重組腸道病毒71型。

背景技術

腸道病毒71型（EV71）屬于小RNA病毒科（Picornaradae）腸道病毒屬（Enterovirus）的成員。EV71的病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結構，無包膜和突起，直徑大約在24～30nrn，核酸為單股正鏈RNA。自20世紀70年代發現腸道病毒71型，已有3次EV71引起的大范圍手足口病（Hand?foot?and?mouth?disease?HFMD）流行，每次都有死亡病例的發生。EV71病毒在學齡前兒童特別是5歲以下年齡組發病率最高，除引發一般的手足口病的臨床癥狀外，還可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣麻痹等多種神經系統疾病，給家庭和社會造成了沉重負擔。

生物熒光示蹤技術是近年來發展起來的一項嶄新的分子、基因表達的分析檢測技術。在分子生物學研究領域，結合熒光示蹤的技術手段，可分別在細胞和動物水平，對標記分子進行熒光示蹤監測和檢測。

Gaussia熒光素酶是分離于夏威夷水域的一種大型海洋橈腳類動物的新型熒光素酶。通過報告基因載體，Gaussia熒光素酶可用于哺乳動物細胞表達。表達后的Gaussia熒光素酶為單條肽鏈的單體酶，其分子較小（187aa），且具有分泌性信號肽，因此可通過內質網分泌到細胞外。該熒光素酶催化底物腔腸素的氧化反應并且發光（480nm），該反應無需ATP參與。與其他熒光素酶相比，使用Gaussia熒光素酶作為報告基因有更多的優勢：1．分泌型熒光素酶，可直接取上清檢測，無須裂解細胞；2．發光強度高，是其它熒光素酶的1千倍；3．反應無須ATP，不受ATP影響；4．穩定性高，對溫度、pH值等耐受性強。

目前尚未有對EV71進行Gaussia熒光素酶示蹤的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種腸道病毒71型的Gaussia熒光素酶示蹤系統及其應用。所述腸道病毒71型的Gaussia熒光素酶示蹤系統即為一種表達Gaussia熒光素酶的重組腸道病毒71型。

本發明所提供的重組腸道病毒71型，是將野生型腸道病毒71型基因組RNA進行替換或插入得到的重組病毒；

所述替換為：將所述野生型腸道病毒71型基因組RNA中的片段a中的任一片段（可由1個、2個或更多個核糖核苷酸組成）替換為片段b；

所述插入為：在所述野生型腸道病毒71型基因組RNA中的所述片段a中的任一位點處插入所述片段b；

所述片段a為序列表中序列1編碼的RNA；所述片段b為含有Gaussia熒光素酶編碼基因的DNA片段編碼的RNA。

所述Gaussia熒光素酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

在本發明中，所述Gaussia熒光素酶的編碼基因的序列為序列表中序列3的第15-575位。

進一步，所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3。

在本發明的一個實施例中，所述野生型腸道病毒71型具體為腸道病毒71型安徽分離株1（Anhui1-09-China）。

在本發明的一個實施例中，所述重組腸道病毒71型是將野生型腸道病毒71型基因組RNA進行插入得到的重組病毒；具體的，所述插入中，所述“片段a中的任一位點”為所述片段a中的序列1的第450位和第451位核苷酸之間。

由于所述野生型腸道病毒71型安徽分離株1（Anhui1-09-China）的基因組RNA經反轉錄后得到的cDNA序列為GenBank號為GQ994988.1的序列（Up?date：2010-5-18），相應的，所述重組腸道病毒71型的基因組RNA經反轉錄后得到的cDNA序列為GenBank號為在GQ994988.1的序列（Up?date：2010-5-18）的第3346位和第3347位（對應序列1的第450位和第451位）之間插入序列表中序列3所示DNA片段，得到的核苷酸序列。

本發明的另一個目的是提供一種制備所述重組腸道病毒71型的方法。

本發明所提供的制備所述重組腸道病毒71型的方法具體可包括如下步驟：

（a）將所述野生型腸道病毒71型基因組RNA通過反轉錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質粒甲；