[發明專利]一種熒光實時PCR法檢測食品中鴨源性成分的方法

在審

• 申請號: 201310225966.0
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN104232742A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 金萍;丁洪流;李培;陳英
• 申請（專利權）人: 蘇州市產品質量監督檢驗所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及動物物種和動物源性成分鑒定技術領域，具體涉及食品中鴨源性成分的方法；尤其涉及一種熒光實時PCR法檢測食品中鴨源性成分的方法。

背景技術：

隨著人民生活水平的提高、食品質量安全監管部門檢測技術的不斷完善和更新，食品摻假的手段也在不斷提高。不法商販、企業為獲得非法利潤，常以較低價的雞肉、豬肉或鴨肉冒充牛、羊肉，再在摻假的肉類中加入各種香精基料，使消費者不能從感官上加以鑒別。由于替代成分通常與被替代成分在生化、理化、感官性質上及其相似，加之食物本身的復雜性和可變性，使得常規檢測方法如電泳、免疫學技術、色譜技術、傳統PCR等多有不足，如靈敏度低、周期長、費時費力。

實時熒光PCR技術以DNA為模板，設計特異引物探針，在封閉的體系中進行擴增和實時檢測，無需電泳就可以對結果進行分析，避免了傳統PCR產物的污染和EB帶來的危害，縮短檢測時間，且擴增目的片段較短，尤其適用加工食品。該發明旨在利用實時熒光PCR技術建立食品中鴨源成分檢測方法，為質檢部門打擊不法商販、維護消費者合法利益提供有力的科學依據。

發明內容：

本發明旨在鑒別食品中是否含有鴨源性成分。

技術解決方案：

基于Genbank上已公布的鴨線粒體細胞色素Cyt?b基因設計鴨特異性的引物探針體系(鴨源性上游引物F：5′-GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3′；鴨特異性下游引物R：5′-GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3′；鴨特異性探針序列P：5′(FAM)-ATGAGGACAAATATCGTTCTGAGGAGCTACCGTA-3′(TRAMA))，以提取的肉(制)品中動物組織DNA為PCR擴增模板，進行鴨特異性擴增探針引物進行實時熒光定量PCR擴增反應，最終對樣品中目標DNA進行判定，達到對樣品中所含成分進行鑒別判斷。主要步驟包括：

1)樣品中DNA的提取；

2)以提取到的DNA為模板，用權利要求1所述引物探針體系進行實時熒光PCR反應，反應體系的體積為25μL：Taqman?PCR?master?mix12.5μL；上下游引物、熒光標記探針各1μL；模板DNA1μL；其余不足用滅菌雙蒸水補齊；

3)在樣品檢測的同時，設置空白對照(以水代替DNA模板)、陰性對照(以非目標肉DNA為模板)、陽性對照(以純鮮鴨肉DNA為模板)；

4)反應循環參數：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40個循環，于實時熒光PCR儀上進行。閾值設置時保證閾值不小于陰性對照的最高熒光值，使陰性對照Ct值大于35；

5)質量控制對照結果：

空白對照：無熒光信號檢出；

陰性對照：無熒光信號檢出(Ct值大于35)；

陽性對照：有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線，Ct值＜28。

6)結果判定：

Ct值小于35，且空白、陰性及陽性對照結果正常者判為檢出鴨源性成分；

Ct值大于35，且空白、陰性及陽性對照結果正常者判為未檢出鴨源性成分；空白、陰性及陽性對照結果結果異常時重做實驗；

本發明的有益效果：

本發明設計了鴨源性成分檢測的特異性引物、探針體系，規定了具體檢測和結果判定方法，可定性檢測食品中的鴨源性成分，進一步完善食品肉種來源鑒別體系，維護消費者權益。

附圖說明

圖1是鴨源性引物探針體系特異性檢測實時熒光PCR擴增曲線

圖2是鴨源引物探針體系靈敏度檢測實時熒光PCR擴增曲線

具體實施方式

1、所用引物、探針體系

鴨源性上游引物F：5′-GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3′；

鴨特異性下游引物R：5′-GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3′；

鴨特異性探針序列P：

5′(FAM)-ATGAGGACAAATATCGTTCTGAGGAGCTACCGTA-3′(TRAMA)

2、基因組模板制備采用一次性的組織研磨棒等實驗器具對樣品進行均質處理，保證樣品的均勻性以及避免樣品間的相互污染，按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進行，最終提取D₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.5～2.0之間的動物組織DNA。