[發明專利]宮頸癌檢測試劑盒及定量和分型檢測方法

無效

• 申請號: 201310224877.4
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN103305408A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 路建偉
• 申請（專利權）人: 煙臺永沐生物科技有限公司
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68
• 代理公司: 上海東亞專利商標代理有限公司 31208
• 代理人: 劉瑩;羅習群

1.一種宮頸癌檢測試劑盒，包括一盛放檢HPV病毒的化學試劑的盒體，其特征在于：該盒體被分成若干個獨立空間，每個獨立空間內放置各種化學試劑及固定試劑的固定裝置。

2.根據權利要求1所述的宮頸癌檢測試劑盒，其特征在于：所述化學試劑為擴增緩沖液、4種dNTP混合液體、引物、TaqDNA聚合酶、16亞型DNA探針、18亞型DNA探針、DNA提取試劑和MgCl₂溶液。

3.根據權利要求1所述的宮頸癌檢測試劑盒的HPV定量和分型檢測方法，包括如下的步驟：

⑴樣品DNA的抽提：

在1ml樣品管中加入0.8mLDNA提取試劑，將待測樣品分散其中，室溫放置5分鐘后，手動劇烈振蕩管體15秒后，15℃到30℃孵育2到3分鐘，4℃下以12000rpm轉速離心15分鐘，可見的DNA沉淀在管的底部和側壁上，形成膠狀沉淀塊；

⑵樣本清洗：

加入50μl超純水和50μl?75%乙醇混合液，用槍反復吹打，離心多次得到純凈的DNA樣本，溶于5μlDNA擴增緩沖液中；

⑶待測樣品的多重熒光定量PCR檢測：?1、所有DNA樣品分別配置反應體系，體系配置如下：

；

2、PCR?擴增與檢測：

a.將反應液放入多重熒光PCR儀中，首先在90°C?-100°C?作用1?min，使DNA預變性，然后進入以下的熱循環，首先變性90°C?-?95℃?1分鐘，此時DNA雙鏈變成DNA單鏈；

b.退火?37℃-65℃?1分鐘，此時單鏈DNA在引物和TaqDNA聚合酶的作用下開始DNA復制，13亞型DNA探針與16亞型DNA探針結合到乳頭瘤的靶向目的DNA處；HPV擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，沒有熒光產生；

c.延伸?65℃-73℃?1分鐘，此時DNA延伸形成的新雙鏈，DNA探針與DNA鏈分離，由于TaqDNA聚合酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，使熒光監測系統接收到熒光信號；

d.如此反復循環30次，循環次數越多，熒光強度越強，通過測定熒光強度從而實現對13種高危型HPV病毒定量，若病毒載量﹥5000拷貝/ml，則判斷為陽性，反之則為陰性，得出患者是否感染HPV病毒。