[發明專利]賦予植物耐寒性的一個棉花P型ATP酶基因Gbpatp的應用

有效

• 申請號: 201310224779.0
• 申請日: 2013-06-06
• 公開（公告）號: CN103382476A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 劉廷利;連梓伊;張保龍;楊郁文;陳天子;袁洪波;陳菲
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.?賦予植物耐寒性的一個棉花P型ATPase基因Gbpatp的應用，包括：

以測序正確的克隆質粒T-easy-Gbpatp為模板，經引物

P1???ATGGAGCTGCATAACAACG

P2???TTAACTGGAATCTTCATCTGGC

高保真酶Ex?Taq進行PCR擴增，PCR擴增反應條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s，59℃退火50s，72℃延伸4min，35個循環；72℃加A10min；

PCR產物按Axygen公司PCR純化試劑盒說明書純化后，依據TA克隆法將Gbpatp基因全長連接到PCXSN上，采用凍融法轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，培養在含有卡那霉素50?mg/L的LB固體培養基上，37℃培養16h～20h，挑取單克隆菌落于含有卡那霉素50?mg/L液體LB培養基中，37℃、200r/min振蕩培養14h，提取質粒，用載體引物pCXFP9??CGAATCTCAAGCAATCAAG及基因的反向引物P2進行PCR篩選3669bp大小片段，陽性克隆命名為PCXSN-Gbpatp，用凍融法將PCXSN-Gbpatp轉化農桿菌LBA4404，轉化子經PCR驗證后保存備用；

隨機挑取合適的農桿菌轉化子，進行PCR驗證，吸取含有陽性克隆的菌液20μl加入到含卡那霉素50?mg／L，利福平50?mg／L?的50ml液體LB培養基中，28℃、130?r／min培養過夜至OD600為0.5，采用葉盤法侵染普通煙草，將侵染過的葉片放于培養基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+cef500mg/L上，黑暗處共培養2天后,將葉片轉移至篩選培養基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+cef500mg?/L+hyg15上，經過篩選后，對所得再生植株，用PCR方法分別在DNA和RNA水平上檢測目的基因是否轉入以及是否成功表達；經分子鑒定后，獲得Gbpatp基因過量表達的煙草T1植株。

2.?根據權利要求1所述的賦予植物耐寒性的一個棉花P型ATPase基因Gbpatp的應用，其特征在于：Gbpatp基因過量表達的煙草T1植株自交后收獲T2種子,

T2種子在含有15mg/L?hygB的1/2MS培養基上進行篩選培養，抗潮霉素煙草生長正常，非轉基因植株無法正常生長，經潮霉素篩選后的T2代煙草苗，提取DNA和RNA，并將RNA反轉錄成cDNA，經引物

hygF：TCGCCTCGCTCCAGTCAATG

hygR：AGGGGGAAGAATCTCGTGCT

擴增356bp大小片段，篩選獲得Gbpatp基因過量表達的陽性轉基因煙草植株。