[發明專利]一種海洋咔啉生物堿的生物合成基因簇及其應用

有效

• 申請號: 201310224447.2
• 申請日: 2013-06-06
• 公開（公告）號: CN103275976A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 鞠建華;陳奇;紀昌濤
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/52;C12N9/00;C12P17/18
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種海洋咔啉生物堿（marinacarbolines，MCBs）的生物合成基因簇及其應用。

背景技術：

β-咔啉化合物是一類自然界中廣泛存在的吲哚生物堿，這類化合物具有共同的β-咔啉三環骨架系統，根據β-咔啉吡啶環飽和程度的不同，可簡單分為四氫系列、二氫系列和全芳香型系列。全芳香型的β-咔啉三環骨架系統是一個完全的平面分子，具有不同的酸堿性，因此，這類化合物的存在形式受pH值和β-咔啉環上取代基的性質和位置的影響。對其研究及藥理學探索發現，β-咔啉類衍生物具有重要的抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和作為一些酶的抑制劑等多方面生物活性，相應的具體機制正在深入研究之中。海洋咔啉生物堿（marinacarbolines，MCBs）是從擬諾卡氏菌科（Nocardiopsaceae）放線菌新屬新種Marinactinospora?thermotolerans?SCSIO00652發酵物中分離得到的四個新的β-咔啉生物堿類化合物，其結構式如圖1（1-4）所示，藥理活性研究表明，這些化合物無細胞毒活性，但對瘧原蟲Plasmodium?falciparum多重耐藥株Dd2及敏感株3D7具有明顯的抑制作用，顯示出較好的抗瘧活性，可將為抗瘧藥物研究開發的先導化合物（這四個化合物已經申請專利“β-咔啉生物堿類化合物及其在制備抗瘧疾藥物中的應用”，授權號為：ZL201110132680.9）。

迄今為止，有關深海放線菌來源的海洋咔啉生物堿編碼基因簇和生物合成的研究國內外尚未見報道。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種海洋咔啉生物堿的生物合成基因簇。

所述的海洋咔啉生物堿，包括四個β-咔啉生物堿類化合物，其結構式如圖1中的式1、2、3和4所示，這四個化合物已經申請專利“β-咔啉生物堿類化合物及其在制備抗瘧疾藥物中的應用”，授權專利號為：ZL201110132680.9。

本發明是以放線菌來源的海洋咔啉生物堿為目標分子，從篩選生物合成基因簇出發，采用分子生物學、微生物學、合成生物學、生物化學以及有機化學相結合的方法研究其生物合成，通過對其生物合成機制的研究，闡明了深海來源的β-咔啉生物堿MCBs形成的主要分子機制，對一些酶的體外反應的研究證實了其相應的催化功能，在此基礎上應用酶學反應獲得了一系列β-咔啉類似物，為利用組合生物合成的方法對MCBs的化學結構進行修飾和改造提供了依據，也為藥物篩選提供了一些化合物實體。

本發明的海洋咔啉生物堿的生物合成基因簇來源于放線菌Marinactinospora?thermotolerans?SCSIO00652，其特征在于，該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第1-4222位的堿基序列所示，包含3個基因，具體為：

（1）負責海洋咔啉生物堿酰胺鍵合成的基因，即mcbA，位于基因簇核苷酸序列（SEQ?ID?NO.1，下同）第1-1488個堿基處，長度為1488個堿基對，酰胺鍵合成酶，495個氨基酸；

（2）負責海洋咔啉生物堿骨架合成的基因，即mcbB，位于基因簇核苷酸序列第1572-2516個堿基處，長度為945個堿基對，編碼Pictet-Spengler反應酶，314個氨基酸；

（3）負責海洋咔啉生物堿脫羧的基因，即mcbC，位于基因簇核苷酸序列第2570-4222個堿基處，長度為1653個堿基對，編碼脫羧酶，550個氨基酸。

SEQ?ID?NO.1（序列表）所示序列的第1-4222位的堿基序列的互補序列可根據DNA堿基互補原則隨時得到。且第1-4222位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈式反應（PCR）或用合適的限制性內切酶酶切相應的DNA或DNA體外合成技術或使用其他合適的技術得到。本發明提供了得到至少包含部分SEQ?ID?NO.1所示序列的第1-4222位中DNA序列的重組DNA載體的途徑。

本發明還提供了產生海洋咔啉生物堿生物合成基因被中斷或其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含有SEQ?ID?NO.1所示序列的第1-4222位中的核苷酸序列。

本發明所提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈式反應（PCR）的方法或包含本發明SEQ?ID?NO.1所示序列的第1-4222位的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與海洋咔啉生物堿的生物合基因簇相似的基因。