[發明專利]一種檢測生物大分子的磁共振免疫傳感方法

無效

• 申請號: 201310222453.4
• 申請日: 2013-06-06
• 公開（公告）號: CN103278521A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 鄒明強;陳翊平
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08;G01N33/531;G01N33/569
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技術領域

本發明涉及一種檢測生物大分子的方法，尤其涉及一種利用聚苯乙烯微球作為免疫親和載體進行待測生物大分子富集并直接參與磁共振免疫反應的傳感檢測方法及相關試劑制備與使用方法。

背景技術

傳染性的植物性致病菌和動物性病毒是出入境檢驗檢疫工作中重點監控對象，對這些傳染性的有害物進行及時、準確、便捷的檢測，對保護人類健康及生命安全、保障國門安全、維護社會穩定具有重要的意義。

目前檢測該致病菌和病毒的檢測方法主要包括分離培養檢測、免疫檢測、分子生物學等方法。分離培養方法簡單、易行，但由于其檢測靈敏度低、耗時長，無法達到檢疫要求。免疫分析法具有簡單、快速、成本低等優點，適合于大規模樣品篩查，但其靈敏度比較低，因此其使用也受到一定的限制。分子生物學方法檢測靈敏度較高，特異性較好，但需要昂貴的儀器和較高的專業技術，因此其應用受到一定限制。因此，口岸檢驗檢疫急需建立一種快速、靈敏檢測致病菌和病毒的方法。

超順磁納米顆粒(Superparamagnetic?particles，SMP)是20世紀80年代出現的一種新型納米磁性材料，因其比表面積大以及在外界磁場下可定向運動，在免疫分離分析、核酸分離與雜交、靶向給藥、核磁共振成像等領域到了廣泛應用。J?Perez等發現SMP在水溶液中當其狀態(分散或者聚集)變化時會引起磁場均勻性發生改變，進而顯著引起周圍水分子質子的橫向弛豫時間(T₂)發生改變。SMP經表面修飾，偶聯上相關抗體/抗原或給體/受體后即可制備成特異性的磁弛豫時間傳感探針(Magnetic?relaxation?switches，MRS)，通過特異性親和反應，使體系中分磁顆粒的狀態發生改變，由于狀態改變的程度與目標分子含量相關，通過弛豫時間的改變可間接得到目標分子的含量。目前，基于SMP的MRS傳感技術具有處理簡單、快速、靈敏、無損、適于現場檢測等優點，在生物分子間相互作用研究、大分子/小分子目標物分析等方面得到了應用。研究表明在MRS體系中，通過增加檢測物的免疫結合位點的方式可以使磁探針狀態的改變量增大，從而提高方法的檢測靈敏度。

免疫親和富集技術具有的選擇性好、富集效率高和分離速度快等優點，在樣品前處理中得到了廣泛的應用。由于納米顆粒的比表面積大，且具有良好的生物相容性和穩定性，因此常作為載體用于免疫親和體系。當這些納米顆粒偶聯上抗體之后，可以從復雜的生物或者環境樣品中提取和富集待測目標物。SMP因其獨特的磁分離優勢，在免疫親和富集方面已得到廣泛應用。然而，基于磁共振弛豫時間傳感原理的檢測方法，SMP是構成傳感探針MRS的中心單元，其狀態的改變(分散或聚集)可直接主導周圍水分子質子的弛豫時間改變，因此SMP不宜作為待測生物大分子親和富集的載體，需要找到一種新的免疫親和載體。

通常，磁共振弛豫時間傳感免疫分析方法系在均相水溶液或懸浮液體系中進行。考慮到聚苯乙烯(Polystyrene，PS)微球密度小(與水接近)，分散性好，膠體性質穩定，懸浮性好等特點，本發明提供一種用PS微球作待測組分富集載體用于樣品前處理和磁共振免疫傳感檢測的方法。一方面簡化了樣品前處理步驟，提高了分析速度，并通過樣品特異性富集而提高了檢測靈敏度；另外一方面，所使用的PS微球與磁共振弛豫時間免疫傳感方法兼容，通過載體上捕獲到的抗原(Ag)與MRS磁探針上的抗體(Ab)發生特異性反應，形成以PS微球為中心的網狀結構，即克服了免疫反應通常面臨的空間位阻問題，又增加了反應結合位點。上述兩方面作用，使磁共振免疫反應中MRS狀態的改變程度增大，從而顯著提高了檢測靈敏度。同時，樣品前處理步驟簡單，分析速度加快。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡便、快速、靈敏檢測生物大分子(細菌和病毒)的磁共振弛豫時間免疫傳感分析方法。采用本發明的方法，用PS微球作為免疫親和載體，在樣品前處理中進行生物大分子Ag的快速提取、富集，同時將PS微球捕獲到的Ag與檢測體系中MRS上偶聯的Ab進行特異性免疫反應，使用低場磁共振分析儀，實現了生物大分子靈敏、簡便、快速檢測，克服了目前分子生物學檢測方法操作復雜、免疫檢測方法靈敏度低等缺點。

利用PS微球作為富集載體的檢測生物大分子的磁共振免疫傳感方法，其分析步驟如下：

1.復合富集試劑(PS-Ab)(1)的制備

1.1磷酸鹽緩沖溶液的配制：磷酸氫二鈉(0.2M)和磷酸二氫鈉(0.2M)按照一定量的比例混合，配制成0.01M磷酸鹽緩沖溶液，pH＝7.0-7.4。