[發明專利]玉米泛素蛋白啟動子基因的PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法

無效

• 申請號: 201310222451.5
• 申請日: 2013-06-06
• 公開（公告）號: CN103343162A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 章桂明;向才玉;凌杏園;潘廣;程穎慧;康林
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N30/02
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;彭愿潔

技術領域

本申請涉及轉基因產品的檢測，特別是涉及一種玉米泛素蛋白啟動子基因的PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法。

背景技術

目前，轉基因棉花、水稻、小麥、玉米、大豆等轉基因作物越來越多，對轉基因作物的檢測研究也成為各國的熱點。其中，轉基因作物中經常使用的啟動子，玉米泛素蛋白啟動子(即篩選基因ubiquitin)是檢測轉基因作物的一個重要靶標基因。目前對玉米泛素蛋白啟動子基因的檢測方法主要采用常規PCR、實時熒光PCR、DNA印跡法、RNA印跡法和基因芯片法等。傳統的常規PCR檢測方法在平臺擴展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標的增加，需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進行優化，并且兼顧擴增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴增產物的方法，區分效率不高，檢測結果不理想。實時熒光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較多重常規PCR檢測方法有優勢，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時提供互不干擾的4個熒光通道，也限制了該技術在檢測通量擴展，并且檢測成本高。DNA印跡法和RNA印跡法，需要轉膜、雜交，操作繁瑣、費用高、檢測時間長，實際應用也較少?；诔Ｒ幍亩嗵譖CR的基因芯片檢測方法，需要多套引物進行擴增，操作步驟繁瑣，并不適合大規模的高通量檢測。

變性高效液相色譜技術(Denaturing?High-performance?Liquid?Chromatography，DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有分辨率好、擴展性強、靈敏度高等優點。該方法在50℃條件分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對的數量決定，樣品的堿基對數量不同洗脫順序也不同，從而產生不同的樣品峰。具體的，當過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會根據分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與DNA?marker比較確定分子量大小，從而判定樣品中是否含有目標檢測基因。PCR-DHPLC，是將PCR與DHPLC相結合的技術，即先采用PCR擴增出靶標序列，然后再對擴增產物進行DHPLC分析，從而提高檢測的靈敏度和特異性。目前，尚沒有玉米泛素蛋白啟動子基因的PCR-DHPLC的檢測方法。

發明內容

本申請的目的是提供一種新的用于玉米泛素蛋白啟動子基因的PCR-DHPLC檢測的引物，以及基于該引物的玉米泛素蛋白啟動子基因的PCR-DHPLC檢測方法。

為實現上述目的，本申請采用了以下技術方案：

本申請公開了一種用于玉米泛素蛋白啟動子基因的PCR-DHPLC檢測的引物，該引物的上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.2所示序列；

Seq?ID?No.1：5’-CAGAAATTGCGTGGCGGA-3’

Seq?ID?No.2：5’-GGGCGAGGAAGGGAAAGC-3’。

需要說明的是，本申請的引物是針對玉米泛素蛋白啟動子基因而設計的特異性引物，能夠對玉米泛素蛋白啟動子基因進行特異性擴增，因此，可以理解，該引物除了用于本申請的PCR-DHPLC檢測以外，同樣適用于常規的PCR檢測，以及其它的基于PCR擴增的檢測，如實時熒光PCR、基因芯片等等。

本申請的另一面還公開了一種玉米泛素蛋白啟動子基因的PCR-DHPLC檢測方法，該檢測方法包括采用本申請設計的引物，以待檢測樣品的DNA為模板進行PCR擴增，對PCR擴增的產物進行變性高效液相色譜分析。

需要說明的是，本申請設計的引物是針對玉米泛素蛋白啟動子基因的特異性引物，因此，可以理解，如果待檢測樣品中含有足量的玉米泛素蛋白啟動子基因成分，即可擴增出相應的靶標片段，并在DHPLC分析時產生相應的洗脫峰。另外，本申請的引物，同時也是根據DHPLC分析的特殊需求設計的，該引物擴增出來的產物能夠很好的適用于DHPLC分析。還需要說明的是，雖然本申請的引物能夠從各種樣品中檢測出玉米泛素蛋白啟動子基因從而判斷出檢測樣品中是否含有轉基因成分，但是，可以理解，這并不適用于含有玉米的樣品，因為玉米種本身就含有該啟動子，無從判斷該啟動子是玉米本身具有的還是轉基因作物具有的。因此，本申請的引物和方法只可用于不含玉米成分的轉基因樣品檢測。

進一步的，本申請的檢測方法還包括以DNA?marker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與DNA?marker的變性高效液相色譜分析結果進行比對。

優選的本申請的檢測方法包括如下步驟：