[發(fā)明專利]施馬倫貝格病毒核衣殼蛋白單克隆抗體及其制備方法

有效

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• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103275219A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 張永寧;吳紹強;林祥梅;呂繼洲;王彩霞;鄧俊花;袁向芬;景宏麗
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/577;C12N5/20;C12R1/91
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程及免疫技術領域，具體地說，涉及施馬倫貝格病毒核衣殼蛋白單克隆抗體及其制備方法。

背景技術

2011年夏秋季節(jié)，德國和荷蘭的某些牛場開始出現一種未知疾病，病牛出現發(fā)熱（>40℃）、體質下降、食欲不振、厭食、腹瀉和產奶量下降等臨床癥狀，有時出現流產癥狀。2011年11月18日，德國弗里德里希洛弗勒研究所（Friedrich?Loeffler?Institute，FLI）利用宏基因組學技術（Metagenomic?technique）和病毒分離技術最終確證導致此次疫情的病原體為一種新型的布尼亞病毒。因該病毒首先從德國西部城鎮(zhèn)—施馬倫貝格的一頭患病奶牛血液中被分離與鑒定成功，故根據分離地點將其暫時命名為“施馬倫貝格病毒（Schmallenberg?virus，SBV）”，并將其引發(fā)的疫病稱為“施馬倫貝格病（Schmallenberg?disease，SBD）”。

SBV的易感動物包括綿羊、牛（奶牛和野牛）、山羊以及馬鹿（Red?deer）、獐鹿（Roe?deer）、羊駝（Alpaca）和歐洲盤羊（Mouflon）等反芻動物。患病牛主要出現發(fā)熱（>40℃）、精神不振、體質下降、厭食、產奶量下降（最高達50%）和腹瀉等臨床癥狀，部分病牛會出現流產癥狀。通常情況下，成年羊不出現異常癥狀，但懷孕羊易出現流產、死胎或產出畸形羔羊，畸形羔羊即使分娩時尚未死亡也往往難以存活，部分發(fā)病養(yǎng)殖場新生羔羊畸形率高達25-50%。截至2013年4月底，正式確認存在施馬倫貝格病的國家有德國、荷蘭、比利時、英國、法國、意大利、盧森堡、西班牙、丹麥、愛沙尼亞、瑞士、愛爾蘭、挪威、瑞典、芬蘭、波蘭、奧地利、斯洛文尼亞、捷克、匈牙利和土耳其，引起了歐盟（EU）、世界動物衛(wèi)生組織（OIE）以及國際社會的高度重視。俄羅斯、烏克蘭、白俄羅斯、哈薩克斯坦、阿根廷、阿爾及利亞、摩洛哥、埃及、約旦、黎巴嫩、美國、日本和中國等眾多國家已經對歐盟相關疫情國家的牛、綿羊和山羊活動物（包括胚胎）及其相關制品（包括肉類、精液和卵細胞等遺傳物質）采取了不同的貿易限制措施；而智利、加拿大、塞爾維亞和瑞士等國則要求受感染國家提供更多的疫情信息和該病的有關資料，并考慮采取相關的貿易限制措施。毫無疑問，施馬倫貝格病的暴發(fā)與流行已經給有關國家造成了巨大經濟損失。幸運的是，截至目前尚未發(fā)現施馬倫貝格病疫區(qū)內與患病動物或動物生產環(huán)境有過密切接觸的人員（主要為畜主和獸醫(yī)）發(fā)病的情況。盡管如此，鑒于布尼亞病毒科的多種病毒具有人畜共患的特性，因此，目前尚不能完全排除施馬倫貝格病毒感染人類的可能。

現有研究結果表明，施馬倫貝格病毒在分類學上屬于布尼亞病毒科（Bunyaviride）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）辛波血清群（Simbu?serogroup），其遺傳特性與辛波血清群的沙門達病毒（Shamonda?virus）、艾羅病毒（Aino?virus）和赤羽病毒（Akabane?virus）密切相關?；谡寄醽啿《緦俨《镜腘基因編碼區(qū)的序列分析結果表明，SBV與沙門達病毒的同源性最高。SBV是一種有囊膜的單股負鏈RNA病毒，病毒粒子表面有糖蛋白纖突，其基因組可分為3個節(jié)段，依次為L、M和S基因節(jié)段。其中，L基因編碼RNA依賴性RNA聚合酶；M基因編碼2種表面糖蛋白Gn和Gc以及1個非結構蛋白（NSm）；S基因編碼核衣殼蛋白N和另一個非結構蛋白NSs。FLI研究所已經將其測得的SBV全基因序列提交到GenBank中（登錄號為：L基因HE649912；M基因HE649913；S基因HE649914）。

目前，德國FLI研究所已經成功建立了施馬倫貝格病的熒光定量RT-PCR檢測方法，可檢測患病牛羊血液樣品、畸形羔羊的腦組織、胎盤、羊水和胎糞等樣品中的施馬倫貝格病毒。為了控制施馬倫貝格病疫情在歐盟各成員國之間進一步傳播與蔓延，FLI研究所已經將其新建的熒光定量RT-PCR檢測方法提供給了荷蘭、比利時、英國、法國和意大利等國家的相關實驗室。同時，FLI研究所利用KC細胞（雜斑庫蠓幼蟲細胞）和BHK-21、Vero細胞已經從患病牛血液中成功分離到了施馬倫貝格病毒，為施馬倫貝格病血清學檢測方法的建立提供了物質保障。目前，FLI研究所已經建立了檢測SBV血清抗體的間接免疫熒光、中和試驗等血清學檢測方法。