[發明專利]一種脫氧膽酸鈉的分光光度檢測方法

在審

• 申請號: 201310221445.8
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN104215589A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 孫勝軍;趙喆;陸瑋;蔡芳;王見冬;高強
• 申請（專利權）人: 北京科興生物制品有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及一種檢測方法，具體地說，涉及一種脫氧膽酸鈉的檢測方法。

背景技術

脫氧膽酸鈉，分子式：C₂₄H₃₉O₄Na，中文別名：3α，12α-二羥-5β-膽烷酸鈉、去氧膽酸鈉，分子量：414.55。脫氧膽酸鈉是白色粉末或結晶性粉末。易溶于水，微溶于無水乙醇，不溶于乙醚。比旋光度約＋42.5°(c=2，水中)。低毒，半數致死量(大鼠，經口)為1370mg/kg。

脫氧膽酸鈉分子能夠改變磷脂酰基鏈的排列，影響其協同性，同時能夠降低磷脂脂質體的穩定性。脫氧膽酸鈉與磷脂雙層膜作用后不僅僅是簡單地鑲嵌在磷脂膜上，而且能夠使磷脂膜形成孔洞或缺陷。由于脫氧膽酸鈉的上述特性，可以用于病毒或者細菌類疫苗生產過程中的細胞消化，抗原純化與滅活，這些反應是一個復雜的生物物理變化過程，反應前后脫氧膽酸鈉的結構和性質不發生變化。

生產上，在細菌類疫苗的生產過程中，發酵液采用脫氧膽酸鈉進行滅活，而在病毒類疫苗的生產過程中也需要添加脫氧膽酸鈉進行前期預處理。脫氧膽酸鈉作為一種外源物質，自身具有一定的毒性。因此，在上述生物制劑有效成分的純化過程中需對其進行去除，而若不能有效去除脫氧膽酸鈉，可能造成脫氧膽酸鈉含量過高從而導致對人體的毒副作用。因此為了有效控制產品質量，在生產過程有效地監控脫氧膽酸鈉的去除趨勢，檢測純化樣品與終產品的含量或者含量，對疫苗的質控起著至關重要的作用。因而建立一種準確地測定生物制品中脫氧膽酸鈉含量的方法對疫苗質量控制意義深遠。

目前對生物制品中的脫氧膽酸鈉含量的檢測尚未有納入到《中華人民共和國藥典》2010年版三部的通用方法。根據《中華人民共和國藥典》2010年版三部第124頁甲型肝炎滅活疫苗(人二倍體細胞)附錄1《脫氧膽酸鈉殘留量測定法》的方法進行多糖等樣品中的脫氧膽酸鈉含量測定時發現試驗方法具有不適用性，不同樣品的檢測結果不同，添加的標準物質的檢測結果普遍偏低，說明檢測結果不準確。

因此，需要建立一種可以在普通實驗室廣泛使用，能夠適用于不同樣品，且檢測靈敏度高的脫氧膽酸鈉的檢測方法。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種可以在普通實驗室廣泛使用，且檢測靈敏度高的脫氧膽酸鈉的檢測方法。

為了實現本發明目的，本發明提供了一種脫氧膽酸鈉的分光光度檢測方法，所述分光光度檢測方法的步驟為：

（1）繪制標準曲線：制備脫氧膽酸鈉標準工作液，用所述的標準工作液配制一系列不同濃度的脫氧膽酸鈉標準品，與硫酸溶液進行反應，分光光度計測定吸光值，以標準品中脫氧膽酸鈉含量(μg/ml)為橫坐標，以吸光值為縱坐標，作出標準曲線；列出線性方程及相關系數，要求相關系數R²≥0.98；

（2）對待測樣品進行采樣，制備加標樣品；

（3）檢測加標樣品：步驟（2）所述加標樣品與硫酸溶液進行反應，反應條件與步驟（1）相同，分光光度計測定吸光值；

（4）計算檢測結果、分析樣品脫氧膽酸鈉的含量。

將各樣品的吸光值代入脫氧膽酸鈉標準曲線方程，計算待測樣品中的脫氧膽酸鈉含量，再乘以待測樣品的稀釋倍數即為該樣本的脫氧膽酸鈉的含量。

計算公式1：脫氧膽酸鈉標準品以及樣本脫氧膽酸鈉濃度計算

y=ax+b，式中，

y——稀釋后標準系列及樣本在387nm處的吸光值；

x——稀釋后標準系列及樣本的脫氧膽酸鈉濃度，μg/ml；

a——標準曲線的斜率；

b——標注曲線的截距；

計算公式2：樣本脫氧膽酸鈉含量計算

C=d×x，式中，

C——樣本的脫氧膽酸鈉含量，μg/ml；

d——樣本的稀釋倍數。