[發明專利]直接分離CD4+和CD8+淋巴細胞的方法

有效

• 申請號: 201310219459.6
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103305464A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 許恒毅;熊勇華;魏華;賴衛華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體是涉及基于納米磁珠的CD4⁺和CD8⁺淋巴細胞分離方法。

背景技術

T?淋巴細胞是機體免疫系統內功能最重要的一群細胞。Ｔ淋巴細胞來源于骨髓的淋巴細胞，執行細胞免疫功能，不僅是直接免疫效應的主體，而且產生多種細胞因子及表達黏附分子，通過與其他免疫細胞直接或間接的接觸，發揮免疫調節作用。在正常機體內各淋巴細胞亞群相互作用，維持著機體正常免疫功能。當不同淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時，可導致機體免疫功能紊亂并發生一系列病理變化。外周血CD4⁺和CD8⁺淋巴細胞作為淋巴細胞亞群中最重要的細胞，其與腫瘤的發生發展以及機體的免疫功能之間有著密切的關系。因此，對CD4⁺和CD8⁺Ｔ淋巴細胞的發育、分化及活化的機制研究顯得越來越重要。然而，正常人外周血中CD4⁺和CD8⁺Ｔ淋巴細胞的含量很低，現有方法還無法對外周血中痕量CD4⁺和CD8⁺Ｔ淋巴細胞直接分離和采集。因此，建立一種高效分離和純化人外周血CD4⁺和CD8⁺Ｔ淋巴細胞的方法，并對其進行表型及生物學功能鑒定，為進一步研究CD4⁺和CD8⁺Ｔ淋巴細胞在免疫應答中的作用提供較高純度CD4⁺和CD8⁺Ｔ淋巴細胞。

免疫磁分離技術是外周血細胞快速分離富集技術的重要組成部分之一，該技術可高效捕獲、濃縮人外周血樣品中靶細胞，提高靶細胞檢測靈敏度。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法（IMS）將抗體連接到磁珠上，然后將連有抗體的磁珠投入樣品液中對目標細胞進行捕獲、富集，磁分離（具體原理見圖2A）。然而，目前該基于微米級免疫磁珠的分離技術存在諸多局限性：1）微米磁珠的比表面積相對較小，降低了磁珠捕獲效率；2）由于微米磁珠自身的顆粒性質，其與細胞之間通過多相反應（multiphase?reaction）結合，通常需要更長的時間去特異性捕獲食品基質中的細胞；3）微米磁珠單分散性較差，在外周血基質中容易發生自身聚集或形成沉淀；4）傳統的免疫磁分離技術，往往是將抗體直接偶聯于免疫磁珠上，此過程常常會導致抗體的活性大大地降低并且導致抗體的空間方向發生改變增大了抗體間的空間位阻效應，從而降低了抗體的捕獲效率5）血液粘稠度高并且其中非CD4⁺和CD8⁺淋巴細胞的血細胞濃度大，微米磁珠容易產生非特異性吸附，難以實現對血液中CD4⁺和CD8⁺淋巴細胞的特異性分離；6）微米磁珠的濃度過高會造成CD4⁺和CD8⁺淋巴細胞的破損（磁場導致細胞表面磁珠互相吸引，使細胞受到擠壓甚至破裂），導致分離的失?。?）磁珠偶聯抗體時，一般采用疏水吸附或化學偶聯方式將具有活性的抗體聯接在磁珠表面?？贵w與磁珠表面距離太近，磁珠本身性質及其表面殘留的疏水或強親水基團容易引起抗體空間構象發生改變，導致抗體生物活性下降。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種捕獲效率高、簡便分離時間短，低梯度磁場下（小于30?T/m）復雜的外周血基質中CD4⁺和CD8⁺淋巴細胞特異性快速分離的方法。

直接分離CD4⁺和CD8⁺淋巴細胞的方法，包括以下步驟：