[發明專利]磁珠分離大腸桿菌O157的方法

無效

• 申請號: 201310219420.4
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103308373A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 許恒毅;賴衛華;熊勇華;魏華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N1/40
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

1.磁珠分離大腸桿菌O157的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)掃帚分子與大腸桿菌O157?特異性抗體偶聯，摩爾偶聯比為1:1，形成掃帚分子-抗體復合物；

(2)將掃帚分子-抗體復合物與長鏈生物素偶聯，加入過量長鏈生物素以封閉掃帚分子上裸露的氨基位點，形成長鏈生物素-掃帚分子-抗體復合物;

(3)將上述長鏈生物素-掃帚分子-抗體復合物溶液加入到樣品溶液中，以捕獲樣品溶液中的目的菌E.coli?O157，形成長鏈生物素-掃帚分子-抗體-E.coli?O157抗原復合物；

(4)將修飾有鏈霉親和素的納米磁珠加入到上述混合溶液中通過鏈霉親和素與長鏈生物素的親和作用捕獲長鏈生物素-掃帚分子-抗體-E.coli?O157抗原復合物，以形成終復合物納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-掃帚分子-抗體-E.coli?O157抗原；將終復合物溶液磁力分離，去離子水輕輕清洗后，用PBS緩沖液混重懸即得富集有大腸桿菌O157的磁珠。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述掃帚分子為氨基化的線性化聚酰胺-胺，其分子量為13000?Da。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1）中掃帚分子通過氨基和E.coli?O157特異性抗體的羧基實現掃帚分子和抗體的共價偶聯。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）中掃帚分子通過氨基和長鏈生物素分子的羧基，實現掃帚分子和長鏈生物素的共價偶聯；加入過量長鏈生物素以保證封閉掃帚分子上裸露的氨基位點。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述修飾了鏈霉親和素的納米磁珠粒徑為20-50?nm?，優選為30?nm。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1）所述的制備摩爾偶聯比為1:1的掃帚分子-抗體復合物，按照如下步驟制備:

（1）取1?mg氨基化的掃帚分子溶解于2?mL?0.02?M，pH?6.5磷酸緩沖液PBS，加入0.6?mg?N-羥基丁二酰亞胺NHSS，0.4?mg?乙基3-（3-二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；

（2）取11.5?mg?E.coli?O157特異性抗體加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；

（3）將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）所述的長鏈生物素-掃帚分子-抗體復合物按照如下步驟制備：

（1）取15?mg?長鏈生物素，3.6?mg?NHSS，2.4?mg?EDC溶解于2?mL?0.02?M?pH?6.5?PBS緩沖液中；

（2）將0.53?mg掃帚分子-抗體復合物加入到上述溶液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；

（3）將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3）和（4）具體包括如下步驟：

取1?mL待測樣品溶液，加入0.15?mg?E.coli?O157抗體和長鏈生物素共修飾的掃帚分子，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min；加入0.15?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速再室溫孵育15?min，常規磁力架分離3?min；磁力分離后，去離子水輕輕清洗后，用PBS緩沖液混重懸即得富集有大腸桿菌O157的納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-掃帚分子-抗體-E.coli?O157抗原復合物。