[發明專利]一組用于檢測斑茅多態性的引物組、檢測方法和用途

無效

• 申請號: 201310219086.2
• 申請日: 2013-06-04
• 公開（公告）號: CN103468790A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 鄢家俊;張建波;白史且;張勁;刀志學;常丹;張昌兵
• 申請（專利權）人: 四川省草原科學研究院;貴州省草業研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及引物組，特別一組用于檢測斑茅多態性的引物組及其用于檢測斑茅多態性的方法及用途。

背景技術

斑茅是禾本科蔗茅屬高大禾草，具有生物量大、抗逆性強、纖維素含量豐富等特點。由于其抗逆性強，能夠與甘蔗進行種間雜交，常作為甘蔗育種中的優良基因來源，是甘蔗育種的主要材料之一。同時由于生物量大、纖維素含量高，已經被視為我國本土優良的生物質能源材料，其能源用潛力巨大。我國熱帶、亞熱帶地區分布大量的野生斑茅資源，搞清楚其遺傳多樣性規律是合理保護利用該資源的前提。在遺傳多樣性研究及遺傳圖譜構建中分子標記至關重要。分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，材料間DNA水平上的多態性的直接反映。主要常用的分子標記方法有RAPD、RFLP、AFLP、SRAP、SSR等，目前斑茅遺傳多樣性的研究并不多，使用的標記有SRAP、ISSR、RAPD和RFLP，未見SSR標記用于斑茅的遺傳多樣性研究。

在研究斑茅遺傳多樣性中，使用了RAPD、RFLP、ISSR和SRAP等分子標記。這些標記中RAPD標記是利用一個隨機序列的寡核苷酸作引物，以基因組DNA作模板進行PCR擴增反應，經瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA序列的多態性,其缺點是但其重現性差；RFLP標記利用基因組DNA經特定限制性內切酶酶切后所產生相當多的大小不等的DNA片段，以同位素或生物素標記的DNA片段作探針，用雜交的方法，把與被標記的DNA相關的片段檢測出來，從而構建出多態性圖譜，簡單的說RFLP就是酶切產生的某一特異DNA片段的長度在個體間的差異，該標記的缺點是操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，不適于大規模；ISSR標記主要是以一條與微衛星(SSRs)序列互補的并在3’或5’端含有2-4個隨機堿基的DNA序列為引物對基因組DNA進行PCR擴增的一種分子標記技術，SRAP標記利用引物設計對ORFs(open?reading?frames，開放閱讀框架)進行擴增，上游引物對外顯子進行特異擴增，下游引物對內含子區域、啟動子區域進行特異擴增，由于內含子、啟動子和間隔序列在不同物種甚至不同個體間變異很大,這就使得有可能擴增出基于內含子與外顯子的SRAP多態性標記，ISSR標記和SRAP標記雖然一定程度上解決了以上兩種標記的缺點，但是他們均為隨機的顯性遺傳標記，不能區分顯性純合基因型和雜合基因型。

發明內容

本發明專利針對斑茅基因組DNA，開發出斑茅遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建及分子輔助育種研究中多態性高、重復性好，標記穩定可靠，易于區分純合基因型和雜合基因型的基因組SSR標記引物。

本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。

本發明旨在解決現有技術問題的至少之一。本發明一方面提供一組SSR引物組，其特征在于，所述引物組包括核苷酸序列SEQ?ID?NO：1-30所示引物。

引物列表見表1

本發明另一方面提供上述SSR引物組在檢測斑茅多態性中的應用。

本發明另一方面提供上述SSR引物組的設計方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

A、提取待測斑茅樣品基因組DNA；

B、用酶切基因組DNA，回收并純化,回收的產物用接頭連接；

C、將連有接頭的DNA片段作為模版進行擴增；

D、將步驟C中擴增產物與生物素探針進行雜交，同時用磁珠對雜交產物進行富集，構建SSR富集文庫；

E、將步驟D中產物連接到載體上轉入到大腸桿菌感受態細胞中，挑取陽性克隆進行DNA測序分析；

F、利用微衛星DNA位點查找軟件對陽性克隆進行搜索，篩選出含微衛星的序列，然后用引物分析軟件在微衛星兩翼設計引物；

G、用不同斑茅材料對開發的SSR引物進行多態性驗證。

根據本發明的具體示例，步驟B中采用內切酶，所述酶為Sau3AI酶。

根據本發明的具體示例，步驟B中酶切后進行純化，用AxyPrep凝膠回收試劑盒回收，加接頭序列緩慢退火連接。

根據本發明的具體示例，步驟C中采用接頭引物擴增，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。