[發明專利]豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201310217682.7
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN104152578A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 童光志;周艷君;吳玉璐
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 周東萍

技術領域

本發明涉及豬流行性腹瀉病毒感染檢測技術領域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒及其應用。

背景技術

豬流行性腹瀉病(Porcine?epidemic?diarrhea，PED)在歐洲和亞洲一些養豬業發達的國家都曾有相關報道，是一種危害較為嚴重的傳染病。最近兩年來在我國部分養豬場再度爆發了以未斷奶仔豬發生水樣腹瀉、嘔吐和高死亡率為特征仔豬腹瀉疫情，該病以7日齡內仔豬發病為主，病程急、傳播迅速、仔豬死亡率高，而且在同一豬場易呈反復發作，曾一度造成部分豬場出現階段性產房無仔的嚴重局面，給養豬業帶來了重大的經濟損失。在對發生仔豬腹瀉疫情的臨床樣品檢測時發現豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的陽性檢出率很高，推測PEDV是此次腹瀉疫情主要病因之一。疫苗免疫是控制疫情的首選，韓國、日本等已經將弱毒疫苗用于該病的預防控制，國內也有一些豬場在使用弱毒疫苗，在臨床上如何區分疫苗免疫與自然感染毒株，對仔豬腹瀉疫情進行有效地預警具有重要意義。

對于PEDV感染的診斷方法已有多種，如對采集的臨床樣品進行處理后，利用病毒適應性細胞進行病毒分離的方法；利用免疫膠體金試紙條直接檢測樣品中的病毒抗原；根據PEDV病毒的保守性內部基因設計引物，利用RT-PCR的方法對病毒的基因進行檢測等方法。其中，病毒分離不僅耗時耗力，而且由于該病毒的特性難于細胞上進行分離培養，因此不利于對疫情的及時診斷，后兩種方法可以實現對病毒的及時、快速診斷，但是卻不能很好的滿足對自然感染與疫苗免疫毒株進行鑒別診斷的需求。PEDV的ORF3基因位于S基因與E基因之間，有研究認為冠狀病毒ORF3編碼的輔助蛋白具有離子通道的特性與病毒的釋放有關，ORF3基因沉默可以降低病毒在Vero細胞上的滴度。

發明內容

本發明要解決目前診斷PEDV感染的方法，不能實現對自然感染與疫苗免疫毒株進行鑒別診斷的技術問題，提供一種豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，該試劑盒特異性強、靈敏性高，可快速、準確地區分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，對于豬流行性腹瀉病毒疫情的早期快速診斷、防控、以及流行病學的全面監測具有重要意義。

為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：

在本發明的一個方面，提供了一種一種豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，所述試劑盒包含：

針對PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245～294位核苷酸序列缺失區設計的一對引物，該對引物的上下游引物分別位于所述ORF3基因缺失區兩端的保守區。

優選的，所述上下游引物的序列如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示。

更優選的，所述引物的使用濃度為25mmol/L。

所述試劑盒還包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列沒有發生缺失的PEDV野毒株對照。

所述試劑盒還包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列發生缺失的PEDV弱毒疫苗株對照。

所述試劑盒還包含：RT-PCR反應緩沖液、反轉錄酶、聚合酶。

優選的，所述試劑盒用于檢測樣品時的PCR退火溫度為50℃。

在本發明的另一方面，還提供了上述豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒在制備診斷豬流行性腹瀉病的產品中的應用。

在本發明的另一方面，還提供了上述豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒在制備區分PEDV弱毒疫苗株與自然感染野毒株的產品中的應用。

本發明基于PEDV?ORF3基因的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，具有特異性強、靈敏性高的特點，不僅能快速檢測出仔豬腹瀉腹瀉樣品中是否存在PEDV，而且還能快速、準確地區分自然感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，可應用于豬流行性腹瀉病的臨床診斷、分子流行病學調查等方面，對于豬流行性腹瀉病的早期快速診斷和防控具有重要意義。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

圖1是本發明實施例1的PEDV流行毒株ORF3基因缺失區域核苷酸序列比較圖；

圖2是本發明實施例1的基于ORF3基因序列建立的進化樹圖；

圖3是本發明實施例2確定RT-PCR最佳Tm值的結果圖；

圖4是本發明實施例2確定RT-PCR最佳引物濃度的結果圖；

圖5是本發明實施例3的RT-PCR特異性試驗結果圖；

圖6是本發明實施例4的RT-PCR方法敏感性鑒定結果圖；

圖7是本發明實施例5臨床樣品的RT-PCR檢測結果圖。