[發(fā)明專利]一種凍干蛋黃抗體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310217409.4
• 申請日: 2013-06-04
• 公開（公告）號: CN103275218A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 張立武;關(guān)受江
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶永健生物技術(shù)有限責任公司
• 主分類號: C07K16/02
• 分類號: C07K16/02;C07K16/08;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 云南派特律師事務所 53110
• 代理人: 龔筍根

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種凍干蛋黃抗體的制備方法。

背景技術(shù)

抗體是指機體內(nèi)B細胞受到外來抗原物質(zhì)刺激后活化、增殖、分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的、能與相應抗原特異性識別和結(jié)合的一類球蛋白。用特定抗原免疫產(chǎn)蛋母雞也可產(chǎn)生相應的特異性抗體，特異性抗體從血液轉(zhuǎn)移至蛋黃，這種特異性抗體被稱為蛋黃抗體，其對某些禽類疫病具有治療和緊急預防作用。

雞蛋黃中含水48％、蛋白質(zhì)17.8％、脂肪30.5％，其中幾乎所有脂肪都與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白，其中，α、β和γ三種活性蛋白為水溶性蛋白，蛋黃抗體是水溶性的γ蛋白。

制備精制蛋黃抗體的過程包括抗原的制備，免疫產(chǎn)蛋雞，抽查雞蛋監(jiān)測抗體效價合格后收集全部雞蛋，分離蛋黃，祛除蛋黃內(nèi)大部分的脂類等物質(zhì)，獲得含有抗體的半透明至澄清透明溶液，即為精制蛋黃抗體。

精制蛋黃抗體保質(zhì)期短（12-18個月），物理性狀不穩(wěn)定（易析出沉淀），抗體效價衰減快，體積大，保存和運輸成本高。為了克服精制蛋黃抗體的缺點，目前國內(nèi)已研究出了凍干蛋黃抗體，凍干蛋黃抗體在相同保存條件下，保質(zhì)期明顯延長；凍干后形成的疏松、團塊狀固體，物理性狀穩(wěn)定；在保質(zhì)期內(nèi)抗體效價穩(wěn)定，不衰減；包裝體積和質(zhì)量均縮小至原體積的1/10至1/20，極大地節(jié)約了庫房面積和運輸成本。

目前將精制蛋黃抗體制備成凍干蛋黃抗體的過程包括對精制蛋黃抗體溶液進行濃縮，檢驗和凍干。凍干抗體在規(guī)格一定的情況下，決定其體積的主要指標是精制蛋黃抗體的效價和濃縮倍數(shù)，在效價一定的情況下，濃縮倍數(shù)越大，含水量越小，凍干抗體的體積越小，單位體積內(nèi)的有效抗體含量越高，單位面積的凍干機板層凍干的瓶數(shù)越多，因為含水量少，在凍干升華階段時間短，電和水的消耗顯著降低。所以，在精制蛋黃抗體效價一定的情況下，其濃縮倍數(shù)對制備凍干蛋黃抗體至關(guān)重要。

目前，濃縮精制蛋黃抗體溶液的主要方法有電泳法、層析法、超臨界二氧化碳氣體抽提法、硫酸銨沉淀法和超濾法等。

電泳法、層析和超臨界二氧化碳氣體抽提法法適合于實驗室少量濃縮蛋黃抗體，成本較高，工藝復雜，不適合規(guī)模化濃縮抗體。

硫酸銨沉淀法濃縮抗體的原理是高濃度的硫酸銨鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，從而使之從溶液中沉淀出來，離心收集沉淀，用緩沖液適當稀釋沉淀，將稀釋溶解后的沉淀裝入透析袋中透析除去硫酸銨殘留物，過濾除菌透析袋內(nèi)溶液即得濃縮的蛋黃抗體，該方法可實現(xiàn)適當規(guī)模的濃縮精制蛋黃抗體溶液，但由于耗時，硫酸銨用量大，成本高，在實際生產(chǎn)中很少使用。

目前廣泛使用的精制蛋黃抗體濃縮方法是超濾法，其原理是由泵提供驅(qū)動力，以超濾膜為過濾介質(zhì)，在一定的壓力下，當原液流過膜表面時，超濾膜表面密布的許多細小的微孔只允許水及小分子物質(zhì)通過而成為透過液，而溶液中體積大于膜表面微孔徑的物質(zhì)則被截留在膜的進液側(cè)，成為濃縮液，從而實現(xiàn)對原液濃縮的目的，在超濾過程中，由于被截留的物質(zhì)在膜表面上不斷積累，會產(chǎn)生濃差極化現(xiàn)象，當膜面溶質(zhì)濃度達到某一極限時即生成凝膠層，使膜的透水量急劇下降，這時必需停止超濾。超濾法濃縮精制蛋黃抗體（分子量180kD)的過程包括將精制蛋黃抗體經(jīng)截留分子量為100kD的超濾膜堆或中空纖維超濾柱過濾濃縮，由于精制蛋黃抗體溶液中含有雜質(zhì)，隨著濃縮倍數(shù)增加，進液側(cè)溶液變得愈加粘稠，超濾膜的透水性銳減，所有一般只能對原液濃縮5～15倍，導致最后凍干的產(chǎn)品體積相對偏大，單位面積的凍干機有效凍干瓶數(shù)少，產(chǎn)品規(guī)格含量低（如以目前農(nóng)業(yè)部批準生產(chǎn)的鴨病毒性肝炎凍干蛋黃抗體為例，25mL凍干用管制瓶中分裝15mL抗體濃縮液，用于250羽雛鴨治療），凍干時間長，能耗高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出了一種凍干蛋黃抗體的制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，該制備方法抗體濃縮倍數(shù)高，制備成本底，凍干時間短，工藝簡單，并且適合規(guī)模化濃縮抗體。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一種凍干蛋黃抗體的制備方法，它以精制蛋黃抗體溶液為原料，將其進行濃縮和凍干，得凍干蛋黃抗體：

1、濃縮：