[發明專利]一種耐熱中性纖維素酶Cel61及其基因和應用

有效

• 申請號: 201310216827.1
• 申請日: 2013-06-02
• 公開（公告）號: CN103320415A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 詹志春;張菁
• 申請（專利權）人: 武漢新華揚生物股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12P19/14
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種耐熱中性纖維素酶Cel61及其基因和應用。

背景技術

纖維素、半纖維素和木質素等是植物細胞壁的主要組成成分。纖維素大約占細胞干重的40～61%，是由葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的線狀結構分子（WongKK,et?al.Microbiol?Rev1988,52:305-317.）。木質素約占細胞干重的15～25%，是一種復雜酚類聚合物。纖維素的降解需要纖維素酶，纖維二糖水解酶，葡萄糖苷酶將纖維寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。按纖維素酶催化反應的最適p?H值,可將其分為酸性纖維素酶(最適p?H值為3～5)、中性纖維素酶(最適p?H值為6～8)和堿性纖維素酶(最適p?H值為8～11)（Zhang?YHP,et?al.Biotechnol?Adv2006,24:612-481.）。

纖維素酶有著廣泛的應用，例如：造紙，釀造，紡織，飼料，生物能源等領域。而同時，由于能源短缺和環境的問題，生物能源作為一種新的替代品而備受人們的關注。目前研究最多的主要為微生物來源的纖維素酶，其中真菌由于其分泌量大，且分泌到胞外而成為研究的熱點。但是，不同的工業應用，對纖維素酶的性質的需求是不同的，如：飼料工業需要嗜酸的纖維素酶，紡織工業需要嗜堿的纖維素酶。目前工業應用的纖維素酶，主要來自木霉屬Trichoderma?reesei和Penicillium?spp.，這些酶的最適pH在5.0左右，最適溫度在50-60度之間，而嗜熱和熱穩定性好的酶則有更好的優勢：耐熱可以提高反應速率，降低底物的粘度，同時還可以抑制其他微生物的生長。

由于不同工業對纖維素酶需求的不同，因此，獲得新型具有優良特性纖維素酶的研究仍具有重大意義。克隆和分離具有中性、熱穩定性好的纖維素酶可以更好的應用于生物能源、紡織等領域。近年來，人們發現糖苷水解酶61家族的纖維素酶具有氧化酶活性，同時發現在瑞氏木霉纖維素酶系中添加少量61家族的纖維素酶可以大大提高玉米秸稈的水解效率。本專利中高溫真菌Humicola?insolens?X9所產纖維素酶大多為高溫中性的特性，并且具有很高的微晶纖維素的降解能力，利于在生物能源工業中應用。本發明中纖維素酶Cel61具有以下性質：最適pH7.0，在pH5～10范圍內具有60%以上的酶活力，最適溫度65℃，良好的熱穩定性，在60℃處理1個小時酶活幾乎沒有損失，并且與復合纖維素酶協同作用可以有效提高玉米秸稈的水解效率。熱穩定性優良并在中性和堿性范圍內具有較高酶活力的特性使其在工業應用上具有很大的潛力。

發明內容

本發明的目的是提供一種能高效應用的耐熱中性纖維素酶。

本發明的再一目的是提供編碼上述耐熱中性纖維素酶的基因。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發明的另一目的是提供一種制備上述耐熱中性纖維素酶的基因工程方法。

本發明的另一目的提供上述耐熱中性纖維素酶的應用。

本發明從腐質霉(Humicola?insolens?X9)中分離得到一種新的耐熱中性纖維素酶Cel61。

本發明提供了一種纖維素酶Cel61，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。SEQ?ID?NO.1：

Mkgllsiaalslavgeasahyifqqlstggtkhpmwkyirqhtnynspvidldsndlrcnvgargagtetvtvaagssl?tfhldtpvyhqgpvsvymskapgsvsdydgsggwfkiqdwgptftgsgatwklddsytfnipscipdgeylvriqslgihn?pwpagipqfyiscaqvrvtgggnanpspqvsipgafketdpgytaniynnfrsytvpgpsvftcsgnsgggsnpsnpnppt?pttfttqvttptpvsppsctvakwgqcggqgysgctnceagstcrqqnayysqci

其中，該酶包括296個氨基酸和一個終止密碼子，N-端19個氨基酸為信號肽，因此，成熟的纖維素酶Cel61的理論分子量為29.5kDa

本發明的Cel61同時具有好的熱穩定性，常溫下，在中性和堿性的范圍內均具有高活性。本發明的纖維素酶，其最適pH值為7.0，在pH5.0～9.0的范圍內維持60%以上的酶活性；最適溫度為65℃，在60℃和70℃具有良好的熱穩定性。