[發明專利]降鈣素原抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201310216386.5
• 申請日: 2013-06-04
• 公開（公告）號: CN103275223A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 吳玉水;黃慶生;謝玉玲;車速
• 申請（專利權）人: 福建省洪誠生物藥業有限公司
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C07K14/585;C12N15/81;C12N15/16
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技術領域

本發明涉及生物物質制備領域，特別涉及一種降鈣素原抗體的制備方法。

背景技術

人體降鈣素原(PCT，Procalcitonin)來自定位于第11號染色體上的單拷貝基因。該基因由2800個堿基對組成，含6個外顯子和5個內含子，基因全長約7600堿基。轉錄后在甲狀腺濾泡旁細胞粗面內質網內翻譯成降鈣素原前體，包括N端84個氨基酸、活性降鈣素(CT，32肽)和降鈣蛋白(katacalcin，21肽)三部分，分別由2肽(-Lys-Arg-)及4肽(-Gly-Lys-Lys-Arg-)連接。降鈣素原前體在內源多肽酶作用下生成116個氨基酸的PCT。PCT是無激素活性的降鈣素前肽物質。在正常情況下，具有激素活性的降鈣素是在甲狀腺濾泡旁細胞產生與分泌，并由細胞內特殊蛋白酶分解PCT成降鈣素。正常人血中PCT濃度非常低，然而在嚴重的細菌感染和膿毒癥時，在外周血液中發現完整的PCT濃度升高。

降鈣素原是一種新的嚴重細菌感染診斷與治療監測的重要臨床指標。新近發現，血清PCT的升高與細菌感染密切相關。在全身系統性嚴重感染中，PCT早期即可升高，經抗生素治療使感染控制后血中PCT會下降。在病毒感染及局部細菌感染而無全身表現的患者，PCT僅輕度升高。血清中PCT濃度的持續升高，反映了細菌感染的最嚴重后果(膿毒血癥、嚴重膿毒癥、膿毒性休克)。感染的持續發展，與PCT水平呈正相關。因此，對于細菌感染和膿毒血癥，高靈敏度、全定量檢測PCT不僅可以進行早期的臨床診斷，而且能夠預測疾病的進程、預后以及對治療方法進行指導，并作為抗生素管理的有效工具。PCT定量檢測擁有早期、快速、更高的靈敏度和特異性等特點，在細菌感染、特別是膿毒癥方面的診斷上，其特異性明顯優于傳統診斷指標。目前，在國外已廣泛應用于臨床各科室。因此，PCT已被用作判斷全身嚴重感染或敗血癥的一個重要的、新的觀察指標。

同其他指標如CRP、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10相比，PCT對嚴重的細菌感染和膿毒癥的早期診斷具有高的靈敏性和特異性，更有利于跟蹤此類疾病的臨床過程。誘發PCT產生的主要原因是機體對細菌內毒素的反應，病毒性疾病、自身免疫病、腫瘤、體內器官的細菌感染并不誘發PCT產生，因此PCT可用于鑒別診斷細菌性和非細菌性疾病，進而用于臨床鑒別診斷。在膿毒癥患者，PCT濃度通常是在10-100ug/L之間或更高。當治療后，PCT濃度將以其半衰期為20-24h的速度降低至正常范圍(＜0.5ug/L)。因此，對PCT濃度的檢測可對臨床威脅生命的感染過程做出監測，同時有助于醫生制定有效的治療方案，并最終控制細菌感染。對于混合重癥監護病房(ICU)患者的臨床研究發現，PCT能夠作為一個選擇性指標，用于膿毒癥的鑒別診斷，將其與系統性炎癥反應綜合癥區分開，并被證實為最好的輔助指標。事實上，PCT不僅是一實驗指標，更重要是能夠監測膿毒癥臨床過程。臨床試驗研究證實，通過PCT對膿毒癥患者診斷和治療過程的監測，為搶救患者提供了寶貴的時間，可以減少不必要抗生素的使用，縮短住院天數，從而降低患者總體治療費用，在降低資源浪費的同時，可快速明確病原學診斷，提高治療效果。

綜上所述，在克隆表達PCT的基礎上，制備抗PCT抗體，可用于制備PCT的檢測試劑，供臨床或研究使用，具有重大的應用前景。而現有PCT的制備都是通過細菌原核表達來制備，尤其是制備的抗體親和力和特異性差。

發明內容

本發明實施例提供一種降鈣素原抗體的制備方法，用于解決現有技術中通過細菌原核表達來制備的降鈣素原所制備的抗體親和力和特異性差的技術問題。

本發明提供的一種降鈣素原抗體的制備方法，包括：構建降鈣素原重組質粒；以降鈣素原重組質粒為表達載體，通過酵母真核表達制備降鈣素原；以及利用表達的降鈣素原蛋白制備降鈣素原抗體。

構建降鈣素原重組質粒的步驟包括：利用引物序列制備降鈣素原基因目的片段；以降鈣素原基因目的片段為模板進行聚合酶鏈反應擴增；以及基于降鈣素原基因擴增產物構建降鈣素原重組質粒。利用引物序列制備降鈣素原基因目的片段的步驟包括：引物F1序列與引物R1序列經變性、退化和延伸獲得第一DNA片段；第一DNA片段與引物R2序列進行退火延伸獲得第二DNA片段；以及第二DNA片段與引物R3序列進行退火延伸獲得降鈣素原基因目的片段；其中，變性處理的溫度為94℃，時間60秒；退火處理的溫度為50℃，時間為60秒；延伸處理的溫度為72℃，時間90秒；引物F1序列含Xho?I酶切位點，引物R3含Spe?I酶切位點。引物序列包括：