[發明專利]食品中羧甲基賴氨酸成分的檢測方法及應用

有效

• 申請號: 201310215874.4
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN103293243A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 林欽;周艷瓊;戴明;張英;鄭小嚴;黃紅霞
• 申請（專利權）人: 福建省產品質量檢驗研究院;浙江大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及食品中羧甲基賴氨酸成分的檢測方法及應用。

背景技術

晚期糖基化終末產物是在非酶條件下，蛋白質、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質的游離氨基與還原糖的醛基經過縮合、重排、裂解、氧化修飾后產生一類穩定的化合物。晚期糖基化終末產物是一類結構多樣性的化合物，在食品以及生物體內以多種不同的單體形式存在，如羧甲基賴氨酸、羧乙基賴氨酸、戊糖苷素、吡咯素等。晚期糖基化終末產物積累于機體的不同組織器官，如血管內皮細胞、神經細胞、腎皮質等組織纖維，它不僅可以直接影響細胞和組織功能、參與疾病的產生，也可以通過與特異受體結合發生反應來改變蛋白質和細胞功能，導致機體的病理變化，如糖尿病及其多種并發癥。

羧甲基賴氨酸（Carboxymethyllysine,?CML）是食品在加工過程中發生美拉德反應時產生的蛋白質化學修飾以及生物體內的糖氧化、脂質氧化和羰基應激的一個重要的生物指標。它是晚期糖基化終末產物最主要的單體之一，常作為檢測食品中或生物體內晚期糖基化終末產物含量的一個重要生物標記物。

目前，尚無食品中羧甲基賴氨酸的國標推薦檢測方法，已報道的羧甲基賴氨酸的檢測方法有：（1）酶聯免疫吸附法（ELISA），通過單克隆抗羧甲基賴氨酸抗體來檢測羧甲基賴氨酸，但該方法的缺點是缺乏選擇性和非特異性，可能會出現假陽性或導致實驗結果過高。（2）色譜法、利用熒光檢測器或質譜儀對樣品中的羧甲基賴氨酸進行分析。使用高效液相色譜（HPLC）結合熒光檢測器時，需要采用衍生劑鄰苯二甲醛對樣品進行柱后衍生或FMOC-CL對生物樣品進行柱后衍生。羧甲基賴氨酸在激發波長260nm和發射波長310nm處有特征吸收峰，利用熒光檢測器對其進行定性及定量，該方法耗時，干擾性強。使用氣相色譜法（GC）或氣相色譜質譜法（GC-MS）時，需要采用易揮發的衍生劑對樣品進行衍生，衍生時間較長，并且操作過程比較復雜。高效液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）、超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)，利用硼氫化鈉對樣品進行還原，三氯乙酸提取蛋白質，6mol/L鹽酸水解蛋白質或酶解蛋白質，蛋白質水解液經固相萃取凈化，然后分析。缺點是離子抑制較強，羧甲基賴氨酸在色譜峰中的保留時間不穩定，不利于定性及定量分析，樣品前處理和流動相中均使用了九氟戊酸離子對試劑，該試劑對質譜儀的損害較大。而本方法在原有方法的基礎上，進行優化和改進后，克服了這些問題，且具有高效、準確、高靈敏度的特點，在分析羧甲基賴氨酸的含量方面有其獨到之處。

發明內容

本發明的一個目的在于填補現有羧甲基賴氨酸檢測技術的不足，提供一種食品中羧甲基賴氨酸成分的檢測方法。本發明的技術解決方案是：

本發明的食品中羧甲基賴氨酸成分的檢測方法，其包括如下步驟：樣品中的蛋白質酸水解后用衍生劑進行衍生，衍生后的溶液經過固相萃取得到待測溶液，采用同位素稀釋超高效液相色譜串聯質譜法對食品中羧甲基賴氨酸成分進行定性和定量分析；所述衍生劑為9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-CL）。

所述的食品中羧甲基賴氨酸成分的檢測方法，其具體包括如下步驟：

1）樣品經脫脂后，用硼氫化鈉進行還原；

2）經步驟1)還原后的產物加入三氯乙酸進行沉淀，沉淀出蛋白質；

3）將沉淀出的蛋白質經鹽酸水解；

4）將水解后的溶液用FMOC-CL溶液進行衍生，得衍生后的溶液；

5）衍生后的溶液經固相萃取后進行濃縮，濃縮后用溶劑溶解，得待測液；

6）待測液采用同位素稀釋超高效液相色譜串聯質譜法進行測定；

與現有技術相比較，本發明是一種利用柱前衍生結合固相萃取凈化以及同位素稀釋超高效液相色譜串聯質譜進行的檢測方法,?本發明建立了FMOC-CL衍生劑對食品中蛋白質水解液進行衍生，然后經過PEP固相萃取小柱進行固相萃取，40%乙腈和二氯甲烷的淋洗，有效除去干擾物質，具有很好的凈化作用，提高靈敏度。羧甲基賴氨酸經過FMOC-CL的衍生后，改變了其極性，更有利于色譜峰中羧甲基賴氨酸保留時間的穩定，改變了液相條件，不再使用NFPA（九氟戊酸）這種離子對試劑，有效保護質譜儀。采用同位素稀釋超高效液相色譜串聯質譜法對食品中的羧甲基賴氨酸的定性以及定量分析，該檢測方法具有分析時間短，靈敏度高，選擇性高，準確度高，穩定性好等特點。能對食品中的羧甲基賴氨酸進行準確定性及定量分析。

附圖說明

圖1衍生產物裂解途徑;

圖2羧甲基賴氨酸標準品的一級質譜圖;

圖3羧甲基賴氨酸標準品的二級質譜圖;