[發明專利]一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法

有效

• 申請號: 201310215492.1
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN104208684A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 姜立新;胡兵
• 申請（專利權）人: 上海市第六人民醫院
• 主分類號: A61K41/00
• 分類號: A61K41/00;A61K9/14;A61P35/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備生物素化脂質氟碳納米粒：

a、將二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC、二棕櫚酰基磷脂酸DPPA、生物素化DSPE-PEG2000-BIOTIN，按照質量比為50:2:5的比例加至丙二醇中，攪拌加熱，70℃下上述脂質混合物溶解，脂質混合物的質量濃度為0.5%～0.6%；

b、當脂質混合物溶解后，逐滴加入體積比為8:1的生理鹽水與甘油的混合溶液，生理鹽水與甘油的混合溶液與丙二醇體積相同；

c、將步驟b得到的脂質混合溶液與全氟戊烷C₅F₁₂按體積比3:1混合，勻化處理制得粒徑為200～500nm的生物素化脂質氟碳納米粒；

（2）制備生物素化尼妥珠單克隆抗體：

d、將長臂生物素酯NHS-LC-BIOTIN以1mg／ml溶于二甲基亞砜DMSO中，尼妥珠單克隆抗體以lmg／ml溶于PBS緩沖液中；

e、按摩爾比30:1將NHS-LC-BIOTIN和尼妥珠單克隆抗體混合，并在室溫下輕晃反應1h，使抗體與生物素酯充分交聯；

f、將步驟e中的混合液移至濾膜管，將濾膜管放置于高速離心機中離心去除未結合的NHS-LC-BIOTIN，濾膜管內存留的即為生物素化尼妥珠單克隆抗體；

（3）制備靶向EGFR氟碳納米粒：

g、將步驟（1）制備得到的生物素化脂質氟碳納米粒加入PBS溶液中稀釋后，緩慢滴加到親和素SA溶液中，親和素SA溶液中親和素SA與DSPE-PEG2000-BIOTIN等摩爾量，在恒溫振蕩器中緩慢振搖充分孵育；

h、將經過孵育的納米粒混懸液離心去除上清液以除去游離的SA，然后加入PBS緩沖液漂洗，重復離心去除上清液至少三次；

i、將親和素、生物素化脂質氟碳納米粒及生物素化尼妥珠單克隆抗體三者按照等摩爾比進行混合，避光以緩慢振搖充分孵育后，最終獲得攜帶EGFR單克隆抗體的靶向氟碳納米粒。

2.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟c中勻化處理的方法為超聲乳化法，超聲波的輸出功率為30～50W,時間30秒。

3.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟c中勻化處理的方法為高壓均質機法，高速電動分散機攪拌，轉速1000～1200轉/分，進行乳化5～10min，最后將混合溶液轉入高壓均質機內60～80Mpa乳化5min即可。

4.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟f中濾膜管為PLTK微孔濾膜管。

5.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟f中，高速離心機以5000r/min的速度離心10min，共2次。

6.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟g中，將生物素化脂質氟碳納米粒加入到2mlPBS溶液中稀釋后，緩慢滴加到8ml親和素SA溶液中，親和素SA溶液中的親和素SA與DSPE-PEG2000-BIOTIN等摩爾量，混合溶液在恒溫振蕩器中4℃、避光以35r／min緩慢振搖充分孵育30min；

7.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟h中，在4℃下以速度1000rpm離心3min。

8.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟i中，避光以35r／min緩慢振搖充分孵育30分鐘。

9.根據權利要求1所述的一種用于增強聚焦超聲療效的靶向EGFR氟碳納米粒的制備方法，其特征在于，所述靶向氟碳納米粒的粒徑為200～500nm。