[發(fā)明專利]豬骨骼肌特異性表達基因myoz1啟動子的克隆及應用

無效

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• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103421790A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設計）人: 蔣思文;尚楊楊;柴進;張鳳;李倩倩;馬娟娟
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到豬骨骼肌特異性表達基因myoz1的不同長度啟動子區(qū)域的分離鑒定及功能驗證。

背景技術(shù)

高等生物基因的表達受到細胞內(nèi)外環(huán)境的精細調(diào)控，因而具有嚴格的時間及空間有序性。基因的表達調(diào)控是一個復雜且有序的過程，由多階段調(diào)控水平共同完成，這主要包括轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后五個水平。其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。啟動子是轉(zhuǎn)錄水平上一個重要的調(diào)控元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，可與眾多的轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控基因的表達(武力1999)。因此深入研究啟動子的結(jié)構(gòu)、功能、作用模式等有利于我們更好的理解相應基因的功能及基因間的互作關(guān)系。

啟動子分類方法較多，根據(jù)啟動子的功能及作用方式可以分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子；根據(jù)啟動子的結(jié)構(gòu)及位置可以分為核心啟動子、近端啟動子及遠端啟動子(Wang?and?Hannenhalli2006；Reddy?et?al2003；Aneja?et?al2008)；根據(jù)核心啟動子的結(jié)構(gòu)又可以分為集中型啟動子和分散型啟動子。盡管啟動子的分類多種多樣，對于真核生物而言，RNA聚合酶II型啟動子起著主要作用(Sandelin?et?al2007)。在組織特異性啟動子調(diào)控的基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特征。具備高轉(zhuǎn)錄活性的組織特異性啟動子是基因工程中的理想啟動子，這類啟動子既能高效啟動外源基因表達，又能使外源基因在特定的靶細胞或靶組織中表達，這比現(xiàn)階段廣泛利用的CMV和SV40啟動子更具有研究和實用價值。

組織特異性啟動子通常以特定的組織細胞結(jié)構(gòu)和化學、物理信號為基礎(chǔ)，可對外源基因進行靶向定位，將基因固定于某一組織或細胞中表達，減少了機體能量和物質(zhì)的損耗及對機體代謝活動的影響，同時又能夠起到定向改善某一組織特性的效果，這在人類疾病治療方面的前景尤其可觀。其次，轉(zhuǎn)基因動物育種研究中，通過組織特異性啟動子調(diào)控外源目的基因在靶組織中表達，能夠有效改善動物的某些性狀，如肌內(nèi)脂肪；或改善動物的消化系統(tǒng)以減少排泄物中的氮磷含量等。鑒于此，組織特異性啟動子在基因工程和轉(zhuǎn)基因育種中越來越受到研究者的青睞。

Myoz1又名calsarcin-2，是與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)結(jié)合的相關(guān)肌源蛋白calsarcin的家族成員之一。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)對鈣離子濃度敏感，當鈣離子濃度達到一定水平后，其可與鈣離子結(jié)合，從而增強去磷酸化的能力。由于calcineurin的去磷酸化作用，可使某些轉(zhuǎn)錄因子激活進入核內(nèi)，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。Calsarcin屬于橫紋肌特異蛋白家族，關(guān)于calsarcin家族最早報道源于Frey的一項關(guān)于心肌鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶互作的研究，發(fā)現(xiàn)了calsarcin-1和calsarcin-2蛋白，并認為它們與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和肌肉收縮元件之間的互作有關(guān)(Frey?et?al?2000)。而Takada通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了myoz1(calsarcin-2)蛋白可與骨骼肌Z線附近的α-actin蛋白互作，這一結(jié)果驗證了Frey的推測(Takada?et?al2001)。豬的myoz1基因位于14號染色體，全長7838bp，包括6個外顯子和5個內(nèi)含子，其翻譯起始位點位于第二外顯子上，編碼區(qū)長度都是897bp，編碼298個氨基酸，通過northern雜交及半定量RT-PCR的方法證明豬的myoz1基因僅在骨骼肌中表達，且在背最長肌中表達量最高(蘇玉虹等2008)。

到目前為止，未見到研究豬骨骼肌特異性表達基因myoz1的啟動子功能的相關(guān)報道。所以申請人對這個基因進行了不同長度啟動子片段的功能研究，以期能夠更好地利用該啟動子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于分離克隆豬的骨骼肌特異性表達基因myoz1啟動子區(qū)域的不同片段，并對其進行功能驗證，以期獲得此基因的具備較高啟動活性并保持肌肉組織特異性的調(diào)控區(qū)段，為動物基因工程提供可利用的組織特異性啟動子。