[發(fā)明專利]動(dòng)物布魯氏菌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310213811.5
• 申請(qǐng)日: 2013-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN103278635A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁家波;秦愛建;王芳;王楠;趙妮;馮忠澤;顧進(jìn)華;馮忠武;張廣川;郭輝;程君生;毛開榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 鄭明

技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種動(dòng)物布魯氏菌病診斷方法——?jiǎng)游锊剪斒暇「?jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，屬生物制品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。?

技術(shù)背景

布魯氏菌病（布病）是由布魯氏菌或稱布魯氏菌（Brucella）引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康。本病不但對(duì)動(dòng)物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計(jì)劃中最重要的目標(biāo)之一。?

布病在世界存在已有久遠(yuǎn)的歷史，人類對(duì)該病的研究認(rèn)識(shí)逐步加深，診斷水平不斷提高，隨著動(dòng)物布病的研究進(jìn)展，動(dòng)物布病血清學(xué)的檢測(cè)方法不斷改進(jìn)和提高。傳統(tǒng)的凝集試驗(yàn)（如：虎紅抗原平板凝集試驗(yàn)、試管抗原凝集試驗(yàn)、乳環(huán)凝集試驗(yàn)）逐漸被敏感性高、特異性強(qiáng)的ELISA方法、熒光偏振試驗(yàn)（FPA）等新的檢測(cè)技術(shù)所取代。?

凝集試驗(yàn)是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實(shí)驗(yàn)、乳環(huán)沉淀試驗(yàn)和抗人免疫球蛋白試驗(yàn)，其中經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)(STAT)、平板凝集試驗(yàn)(PAT)，以上方法在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)基本停止使用，取而代之的是緩沖布魯氏菌抗原凝集試驗(yàn)如虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)。虎紅平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價(jià)格便宜，操作方便，檢測(cè)快速，適于動(dòng)物群體布魯氏菌病的普查。在國際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測(cè)的指定試驗(yàn)，在我國也用于人布魯氏菌病監(jiān)測(cè)的初篩。乳環(huán)沉淀試驗(yàn)依然是乳牛布魯氏菌監(jiān)測(cè)的主要方法，該方法直接對(duì)牛乳進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)奶牛群體進(jìn)行篩檢，該方法簡(jiǎn)便快速。凝集試驗(yàn)主要檢測(cè)抗布魯氏菌LPS-O鏈的抗體，而布魯氏菌的LPS-O鏈?zhǔn)嵌喾N革蘭氏陰性菌的共同抗原，因此布魯氏菌與其他革蘭氏陰性菌存在的交叉感染用試管凝集試驗(yàn)無法鑒別，這也是布魯氏菌病診斷存在的一大難題。?

在布魯氏菌病血清學(xué)檢驗(yàn)中一致認(rèn)為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）在特異性上優(yōu)于其他方法，常被用來對(duì)試管凝集試驗(yàn)和虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽性或可疑的病例進(jìn)行定性檢測(cè)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一直被認(rèn)為是最有效的布病診斷方法，至今尚沒有一種診斷方法能取代補(bǔ)體結(jié)合試?驗(yàn)在血清學(xué)診斷中的地位。但補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)所需要的溶血素的制備困難，試驗(yàn)操作繁瑣，難以在臨床上普遍使用，而且由于豬體內(nèi)的補(bǔ)體會(huì)干擾豚鼠補(bǔ)體的作用，導(dǎo)致敏感性下降。?

ELISA是一種與CFT效果相當(dāng)?shù)脑\斷方法，該方法操作方便，靈敏度高，特異性較好，一次可以完成大量樣品的檢測(cè)，既可以作為篩選試驗(yàn)應(yīng)用于動(dòng)物群體檢疫，還可以作為確診試驗(yàn)。ELISA不僅可以應(yīng)用于血清抗體的檢測(cè)，還可應(yīng)用于乳樣中抗體的檢測(cè)。牛的布魯氏菌病ELISA檢測(cè)方法已是國際貿(mào)易中指定的檢測(cè)方法之一，其他種布魯氏菌的ELISA檢測(cè)方法也是研究的熱點(diǎn)。目前，用于布魯氏菌病檢測(cè)的ELISA有間接ELISA（iELISA）和競(jìng)爭(zhēng)ELISA（cELISA）兩種。?

由于cELISA使用的是針對(duì)布魯氏菌LPS的特異性單克隆抗體與待檢動(dòng)物血清中針對(duì)布病的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，使用的二抗是針對(duì)小鼠IgG的酶標(biāo)抗體，所以相對(duì)于iELISA而言，cELISA可以同時(shí)檢測(cè)豬、牛和羊的血清，而目iELISA只能是針對(duì)其中某一種分別建立診斷試劑盒。因此，cELISA試劑盒具有更廣泛的宿主適應(yīng)性。但目前商業(yè)化的cELISA試劑盒存在的主要技術(shù)缺陷在于不能有效排除耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157感染動(dòng)物的血清干擾，從而使其特異性受到一定程度影響。?

由耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157（特別是O157：H7型）細(xì)菌中脂多糖（LPS）與布魯氏菌LPS具有極高的同源性，干擾了布魯氏菌病的診斷。到目前為止，無論是傳統(tǒng)的凝集試驗(yàn)，還是現(xiàn)在被廣泛使用的ELISA試劑盒，都不能有效區(qū)分以上2種細(xì)菌感染動(dòng)物的血清，因而給布病的診斷帶來了潛在的非特異性。有研究擬使用布魯氏菌的外膜蛋白OMP28、OMP31等蛋白建立布魯氏菌的診斷試劑盒，但均因以上蛋白特異性抗體的產(chǎn)生與感染細(xì)菌的種屬及被感染動(dòng)物的品種存在嚴(yán)格的依賴性，導(dǎo)致其使用范圍嚴(yán)重受限，從而失去了其進(jìn)一步被開發(fā)成試劑盒的可能。?

本發(fā)明的目的在于另外，國外同類技術(shù)抗原多采用牛種布魯氏菌A99株，主要用于檢測(cè)牛布魯氏菌病。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于制備一種能有效排除小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157對(duì)布魯氏菌病檢測(cè)的干擾和對(duì)豬、牛、羊的布魯氏菌病均能檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒。?