[發明專利]一種鑒別金銀花和山銀花的PCR-RFLP方法

無效

• 申請號: 201310213342.7
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN103290127A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 朱云國;王慶霞;程舟;楊曉伶;李珊
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

技術領域

本發明屬于中藥材種質鑒定技術領域，具體涉及一種鑒別金銀花和山銀花的PCR-RFLP方法。

背景技術

2010年版《中華人民共和國藥典》上記載金銀花即忍冬科植物忍冬（Lonicera?japonica?Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera?macranthoides?Hand.?-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera?hypoglauca?Miq.）、華南忍冬（Lonicera?confusa?DC.）和黃褐毛忍冬（Lonicera?fulvotomentosa?Hsu?et?S.C.Cheng.）干燥花蕾或帶初開的花。金銀花與山銀花在植物形態和藥材形狀上非常相似，較難分別。但金銀花和山銀花的藥效和藥性卻存在明顯區別：金銀花含綠原酸和木犀草苷，性涼，清熱解毒、疏風散熱功效佳；而山銀花含綠原酸但木犀草苷微乎其微，性偏熱，藥效欠佳。金銀花由于產量低、管理成本高、市場需求大，所以價格貴，而山銀花產量大、易于采摘、便于管理，價格低。山銀花雖藥效欠佳，但與金銀花的市場價格相差1/3以上，很多不良商販用山銀花冒充金銀花。所以建立一種快速有效的鑒定金銀花與山銀花藥材的方法非常有必要。傳統的形態鑒別和成分分析，很難鑒定摻雜在金銀花中的山銀花，形態鑒別主觀性強，成分分析實驗操作復雜、結果穩定性欠佳。PCR-RFLP用于近緣種的鑒別已有許多成功范例，具有快速、簡單、準確等優點。但這種鑒別對不同的物種，所用的引物、限制性內切酶的種類及鑒別方法都不相同。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒別金銀花和山銀花的PCR-RFLP方法，包括金銀花的特征堿基DNA序列內的一種限制性內切酶位點及與山銀花的區別。

本發明提出的鑒別金銀花和山銀花的PCR-RFLP方法，首先從金銀花及山銀花藥材樣品中提取總DNA，利用一對引物進行PCR擴增一段DNA片段，經純化后對該DNA片段進行測序，建立各樣品的DNA數據庫，利用生物信息學軟件Mega5.0進行序列比對，找出金銀花與山銀花的差異位點，利用軟件DNAman進行限制性酶切位點分析，選擇合適的DNA限制性內切酶，達到快速、準確鑒別金銀花和山銀花的目的。對需要鑒定的供試樣品，提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物（Y1、Y2）擴增出一段DNA片段；用限制性內切酶CfrⅠ或其同切酶EaeⅠ對供試品的PCR擴增產物進行酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，若只有一條722bp的條帶則供試樣品為山銀花，若有196bp和526bp兩條帶則供試樣品為金銀花。具體步驟如下：

(1)從金銀花及山銀花藥材樣品中提取DNA，利用改良CTAB法，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調節至0.1~0.3μg/μl；

(2)通過一對引物，利用聚合酶鏈式反應（PCR），擴增步驟(1)得到的一段DNA，其中：用于PCR的一對引物的DNA序列為：

Y1：5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’

Y2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

(3)對步驟(2)得到的PCR產物中加入限制性內切酶CfrⅠ或其同切酶EaeⅠ，進行酶切，限制性內切酶CfrⅠ或其同切酶EaeⅠ的酶切位點為：Y^∧GGCCR；

(4)瓊脂糖凝膠電泳分析；

(5)鑒定結果的判斷：若只有一條722bp的條帶則供試樣品為山銀花，若有196bp和526bp兩條帶則供試樣品為金銀花。

本發明中，步驟(2)中所述擴增程序為：94℃預變性4?min；94℃?1?min，50℃?2min，72℃?1min，30個循環；72℃延伸10?min。

本發明的效果是：可解決金銀花與山銀花藥材的鑒別問題，提供鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應條件、一種限制性內切酶。與山銀花相比，金銀花藥效更佳、需求量大、供不應求，市場價格高出1/3以上。然而，金銀花與山銀花藥材外形非常相似，難以通過形態、顯微等特征進行快速、準確鑒別。本發明利用金銀花與山銀花DNA序列的差異，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鑒別方法，對于保證金銀花的藥材質量，打擊用山銀花冒充金銀花的不良行為，保護消費者權益具有重要的價值。

附圖說明