[發(fā)明專利]凹凸棒土的改性方法和凹凸棒土固定配位體蛋白A或蛋白G的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310212065.8
• 申請(qǐng)日: 2013-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103303933A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡沂淮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 胡沂淮
• 主分類號(hào): C01B33/40
• 分類號(hào): C01B33/40;C07K17/14
• 代理公司: 淮安市科文知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 32223
• 代理人: 謝觀素

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及凹凸棒土領(lǐng)域，具體涉及一種凹凸棒土的改性方法和凹凸棒土固定配位體蛋白A或蛋白G的制備方法。

背景技術(shù)

在血漿中含有豐富的免疫球蛋白，免疫球蛋白的主要作用是參與免疫反應(yīng)，從而阻斷病原體對(duì)機(jī)體的危害，使病原體失去致病作用。免疫球蛋白作為重要的生化藥用產(chǎn)品，既可以廣泛的應(yīng)用于臨床治療，又可以作為添加劑應(yīng)用于飼料業(yè)、日化工業(yè)和食品工業(yè)，具有較高的經(jīng)濟(jì)附加值。蛋白A是從A型金黃色葡萄球菌分離而得的一種細(xì)胞壁蛋白，蛋白G是從G型鏈球菌分離而得的細(xì)胞壁蛋白。它們性質(zhì)相似，是能在免疫球蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)之外的區(qū)域，形成含有蛋白A-抗體或蛋白G-抗體的復(fù)合物，與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。它們對(duì)多種免疫球蛋白及其亞類有較高的結(jié)合能力。基于蛋白A或蛋白G的這些特性，可以將蛋白A或蛋白G作為配位體，制成親和色譜的固定相，而用于抗體的制備和純化。目前，市場(chǎng)上有多種不同的結(jié)合有蛋白A或蛋白G配體的基質(zhì)，這些結(jié)合有蛋白A或蛋白G的基質(zhì)在受到一定壓力后，會(huì)造成蛋白A或蛋白G的流失，同時(shí)在制備的時(shí)候不僅操作繁瑣、過(guò)程復(fù)雜，而且抗體純化的效果也令人不夠滿意。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種凹凸棒土的改性方法和凹凸棒土固定配位體蛋白A或蛋白G的制備方法，制備工藝簡(jiǎn)單，對(duì)配位體蛋白A或蛋白G的固定效果較好，固定配位體蛋白A或蛋白G的凹凸棒土對(duì)于抗體的提純效果明顯。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

凹凸棒土的改性方法，包括以下步驟：

1）純化：將凹凸棒土與水進(jìn)行混合，并在55~65攝氏度的溫度下進(jìn)行震蕩攪拌至懸浮液中的凹凸棒土顆粒充分水化分散；

2）靜置分層后，倒出上層懸浮液，對(duì)其進(jìn)行離心分離得到固體凹凸棒土，之后對(duì)凹凸棒土進(jìn)行加熱干燥；?

3）熱活化：將干燥后的凹凸棒土進(jìn)行研磨，將研磨后的凹凸棒土在溫度280~320攝氏度的溫度下加熱2~4小時(shí)；?

4）改性：待加熱后的凹凸棒土冷卻至室溫后，再將凹凸棒土加入到偶聯(lián)劑水溶液中，用無(wú)機(jī)酸調(diào)節(jié)PH值為3~4，充分?jǐn)嚢杌旌希筮M(jìn)行液固分離；?

5）對(duì)步驟4）液固分離后的凹凸棒土用水洗滌，之后進(jìn)行真空烘干；

6）將烘干后的凹凸棒土進(jìn)行研磨，將研磨后的凹凸棒土加入戊二醛水溶液中充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)，之后進(jìn)行液固分離；戊二醛是一種具有雙官能團(tuán)的試劑，凹凸棒土經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑KH-550改性后表明含有-NH2，采用戊二醛處理，使載體上接枝的末端-NH2與戊二醛反應(yīng)，形成Schiff堿(C=N)；與此同時(shí)，戊二醛的另一端的-CHO可與自由氨基反應(yīng)，也可發(fā)生Schiff堿反應(yīng)，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白A或蛋白G的固定；

7）對(duì)步驟6）液固分離后的凹凸棒土用水洗滌，之后進(jìn)行真空冷凍干燥得到改性凹凸棒土；

本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟1）中凹凸棒土與水的質(zhì)量混合比為1:15~25。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟2）、步驟5）、步驟7）中干燥溫度分別為105~115攝氏度、70~90攝氏度、-85~-75攝氏度

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟3）、6）中研磨后的凹凸棒土目數(shù)至少為200目。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟4）中所述偶聯(lián)劑水溶液的濃度為5%的硅烷偶聯(lián)劑KH-550水溶液；所述無(wú)機(jī)酸為鹽酸溶液。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟6）中戊二醛水溶液的濃度為0.5%。

凹凸棒土固定配位體蛋白A或蛋白G的制備方法，包括以下步驟：

8）將上述制備得到的改性凹凸棒土加入蛋白A或蛋白G溶液中，在冰浴中緩慢震蕩至少12小時(shí)，取出后進(jìn)行真空冷凍干燥得到凹凸棒土固定配位體蛋白A或蛋白G；所述蛋白A或蛋白G溶液為蛋白A或蛋白G溶解于含0.05%吐溫-20的pH7.2的磷酸鹽緩沖液，即PBS緩沖溶液中得到，蛋白A或蛋白G重量與PBS緩沖溶液的體積比為1:1；

9）將步驟8）干燥后的凹凸棒土固定配位體蛋白A或蛋白G加入到賴氨酸溶液中，在0~6攝氏度的環(huán)境溫度下放置至少4小時(shí)，之后離心分離，置于4℃，備用；由于凹凸棒土上還有多余的醛基，所以在使用前必須封閉多余的醛基，使用賴氨酸以封閉殘留的醛基。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟8）中所述蛋白A或蛋白G溶液濃度為每毫升含1毫克蛋白A或蛋白G。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟8）中所述真空冷凍干燥的溫度為-85~-75攝氏度。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟9）中所述賴氨酸溶液的濃度為0.2mol/L。

本發(fā)明的有益效果在于：