[發明專利]熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途

無效

• 申請號: 201310211821.5
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103251944A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 李曉波;李艷紅;陸雪瑩;肖向文
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆理化技術研究所
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61P37/04;A61P35/00;C12N5/09
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 張莉

技術領域

本發明涉及一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，屬于生物工程和生物免疫學領域。

背景技術

肝癌是目前世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，治愈性肝切除以及肝移植是目前肝癌病人的首選方法，但是由于肝癌的肝內多發病灶、肝外轉移及供體缺乏的因素，診斷出的病人中僅有10%～15%的病人可以接受手術治療。臨床資料還顯示，大多數肝癌患者對化療、放療不敏感，且對正常細胞造成一定的損害，毒副反應大，易復發，因此肝癌的臨床治療迫切地需要新技術和新方法。近年來，腫瘤免疫治療已成為繼手術、化療和放療后另一種很有前途的治療手段。其吸引人之處在于能夠激發患者自身免疫系統，誘發高特異性免疫反應，不僅實現對腫瘤病灶的腫瘤細胞的特異性殺傷，而且還可以消除血液和淋巴系統中的癌細胞，有效地阻止癌細胞轉移，因此，成為近年來國內外研究的熱點。

肝腫瘤細胞疫苗是將自身或異體同種肝癌細胞經過物理因素(照射、高溫)、化學因素(酶解)以及生物因素(病毒感染、基因轉染等)的處理，改變或消除其致瘤性，保留其免疫原性，免疫機體，刺激機體產生特異性抗腫瘤免疫，以達到治療肝癌、預防肝癌轉移和復發的目的。然而，腫瘤疫苗研制過程中存在的一個共同問題是大多數腫瘤抗原的免疫原性弱，抗原表位少，表達分布不同，很難引起機體特異性免疫應答，需添加佐劑來增強其免疫原性。

鋁鹽佐劑是目前唯一全球公認的人用佐劑，但存在對蛋白亞單位疫苗誘導抗體產生的能力較弱，激發細胞免疫應答能力差等，而且在某些情況下，還會產生與過敏反應有關的IgE，其副作用難以避免。因此，需要研發更為安全有效的人用新型佐劑，尤其是安全無毒、能夠刺激較強細胞免疫應答的佐劑。近年來，從藥用植物中提取安全、高效的自然組分作為免疫佐劑成為佐劑研究的趨勢。

熊果酸（Ursolic?acid,UA），又名烏索酸、烏蘇酸，是存在于天然植物中的一種五環三萜類化合物，以游離形式或與糖結合成苷的形式分布于枇杷葉、熊果、女貞子、山楂、車前草、夏枯草、白花蛇舌草等多種植物中。研究發現其具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、增強免疫功能等多種生物學效應。經系統查閱文獻和專利資料，目前未發現熊果酸在抗腫瘤免疫佐劑方面的用途。

發明內容

本發明的目的是提供一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，該方法是將熊果酸和H22細胞共培養，采用常規方法制備肝癌細胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，結果表明熊果酸為佐劑的疫苗免疫小鼠后，荷瘤小鼠腫瘤的生長明顯抑制，小鼠的生命延長率明顯高于模型組，胸腺等免疫器官得到保護，脾淋巴細胞增殖能力顯著升高，血清中細胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高，CD4⁺/CD8⁺T細胞含量比例明顯升高，免疫熒光顯示免疫小鼠血清可與H22細胞發生特異性結合，ELISA從血清中檢測到高滴度抗體。熊果酸作為佐劑制備的肝腫瘤全細胞疫苗，可有效的提高肝腫瘤疫苗的免疫原性，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗安全，無毒，來源廣泛，克服了目前免疫佐劑單一，免疫效果低，副作用難以避免的問題。

本發明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，按下列步驟進行：

a、在對數生長期H22腫瘤細胞5×10⁷個接種于1ml含滅活的10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，加入20μmol/mL的熊果酸培養48h；

b、離心棄上清液，剩余物細胞懸浮于1ml生理鹽水中，再放入液氮中冷凍，時間5-10分鐘，再將冷凍物取出，放入溫度37℃水融化，反復5-8次，即可得到熊果酸免疫佐劑疫苗。

一種所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝腫瘤全細胞的疫苗。

一種所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備預防肝腫瘤全細胞的疫苗。

本發明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，其中熊果酸的結構式為：

本發明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗中，包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細胞的活性成分；其中所述的活性成分為蛋白質、多肽、脂類、蛋白質多肽復合物、DNA分子、RNA分子、腫瘤相關抗原或特異性腫瘤抗原。

本發明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，通過所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝癌腫瘤全細胞和預防肝癌腫瘤全細胞的新用途，其中：