[發明專利]一種用于區分貝類顆粒血細胞類型的方法

無效

• 申請號: 201310211319.4
• 申請日: 2013-05-30
• 公開（公告）號: CN103308513A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 林聽聽;來琦芳;么宗利;周凱
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N1/30
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于貝類血細胞免疫學領域，特別涉及一種用于區分貝類顆粒血細胞類型的方法。

背景技術

貝類是我國海水養殖的主導種類，在海水養殖業中占有舉足輕重的地位。然而近年來，隨著養殖面積的盲目擴大、養殖生態環境的不斷惡化以及缺乏科學合理的養殖規劃與管理等，我國的貝類養殖業漸趨出現了一系列的養殖共性問題，其中就有親貝種質退化明顯，幼貝免疫力和抗病力下降、易發病這一問題。針對這一問題，目前尚未切實可行的防治方法，其很大一部分原因是貝類的免疫抗病機制還不是十分清楚。因此，深入研究貝類的免疫防御機制，繼而提高其抗病力并培育抗病品系，是緩解目前貝類病害頻發的有效手段之一。

貝類缺乏免疫球蛋白和特異性免疫，其免疫防御過程是由血細胞和血淋巴中的體液因子協同完成。血細胞通過自溶、聚集、吞噬、包囊、胞吐、氧化殺傷等方式，達到識別、包裹和清除外來異物的目的；血細胞還能通過釋放溶菌素、凝集素、調理素等物質來調理輔助體液因子免疫，其在貝類抵御外界環境刺激及外來病原微生物侵襲的過程中起著關鍵作用。貝類血細胞根據胞質顆粒有無可分為透明血細胞和顆粒血細胞。研究表明顆粒血細胞較透明血細胞具更強的吞噬性、包囊及活性氧釋放能力，更易在抵御病原入侵和機體免疫修復過程中發揮作用。

顆粒血細胞根據胞質的酸堿性通常分為嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，盡管在極少數貝類中也發現了嗜中性粒細胞的存在。關于嗜酸性和嗜堿性粒細胞的研究，目前多集中于形態和染色親和性方面，常見的染色方法為麥格—吉姆薩法（May-Grunwald?Giemsa，MGG）。至于這兩種粒細胞免疫功能及差異的研究，目前報道甚少，其主要制約因素有兩：一要確保被研究的細胞處于存活狀態；二要有簡便的、適宜的指示劑將這兩種粒細胞快速、清晰地區分開來。目前常用的細胞免疫學方法往往只能滿足其一：如MGG法雖然可以準確地將這兩種粒細胞區分開來，但被其染色的細胞經乙醇固定后處于非存活狀態；流式細胞術雖然可以保持被研究的細胞處于存活狀態，但其無法在散點圖上將這兩種粒細胞清晰地區分開來。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種用于區分貝類顆粒血細胞類型的方法，該方法無需細胞固定、對細胞操作少、能最大程度地確保細胞存活，并能清晰地區分顆粒血細胞類型。

本發明的一種用于區分貝類顆粒血細胞類型的方法，包括：

（1）用磷酸鹽緩沖液將中性紅按質量比100:1～3溶解，經過濾后于4～5℃保存，得中性紅儲備液；使用前稀釋，得中性紅使用液；

（2）制備貝類血細胞懸液；取1～2ml中性紅使用液和1～2ml血細胞懸液，于細胞培養板孔中混勻，染色30～40min后，取一滴混勻液滴加于載玻片上，鏡檢來觀察貝類顆粒血細胞的類型。

所述步驟（1）中的磷酸鹽緩沖液的組分為：氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，磷酸二氫鉀0.2g，蒸餾水1000ml，pH為7.2。

所述步驟（1）中使用磷酸鹽緩沖液10倍稀釋中性紅儲備液。

所述步驟（2）中的細胞培養板孔為24孔細胞培養板孔。

中性紅是一種對細胞無毒害的弱堿性活體染料，遇酸性物質變紅，遇中性或弱堿性物質不變色或變淡黃色，即細胞染色后無論是顆粒血細胞還是透明血細胞，其細胞核因核酸緣故都會變紅；而胞質方面，嗜酸性粒細胞變淡黃色，而嗜堿性粒細胞變紅。

有益效果

本發明具有快速、準確、操作簡單等特點，但其最大的特點還在于：相比于傳統的MGG染色法，本發明無需細胞固定、對細胞操作少、能最大程度地確保細胞存活，并能清晰地區分顆粒血細胞類型，這對今后從活細胞層面上研究嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的吞噬能力、運動能力、產活性氧能力及傷口修復能力等提供了一種非常便捷實用的方法。

附圖說明

圖1為本發明實施例1區分三種貝類顆粒血細胞類型的結果；A，B，C分別為波紋巴非蛤、巨牡蠣和櫛孔扇貝；其中H為透明血細胞，E-G為嗜酸性粒細胞，B-G為嗜堿性粒細胞，bar=10μm。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1