[發明專利]一種銹斑蟳微衛星標記的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201310211317.5
• 申請日: 2013-05-30
• 公開（公告）號: CN103305611A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 馬洪雨;夏連軍;鄒雄;馬凌波;馬春艷;陸建學;蔣偉;李淑娟;劉月星
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種銹斑蟳微衛星標記的快速檢測方法，包括：

（1）提取銹斑蟳基因組DNA；

（2）根據GeneBank數據庫中銹斑蟳的功能基因序列，獲得含有微衛星重復的核心基因序列；序列如下所示：

Xfe-MIH-1：如SEQ?ID?NO:1所示；

Xfe-MIH-2：如SEQ?ID?NO:2所示；

Xfe-MIH-3：如SEQ?ID?NO:3所示；

（3）設計微衛星特異引物，具體如下：

Xfe-MIH-1:F:TGCGAGACTCACTCAACACT

????????R:TTATGTTGTACACCGCTCCA

????????退火溫度為55℃，核心重復序列為(CA)₂₃；

Xfe-MIH-2:F:CTTAGTTATTCCGTCCCGTTTA

?????????R:TTAGCCCGCCCTATCTTCTC

?????????退火溫度為55℃，核心重復序列為(GT)₄N₆(GT)₈GC(GT)₂；

Xfe-MIH-3:F:GTAGCGAAGGTACGAGAAGC

?????????R:GAAGATCGGAAACAATGAGC

?????????退火溫度為56℃，核心重復序列為(GT)₁₄；

（4）利用上述引物對銹斑蟳不同個體的基因組DNA進行PCR擴增；

（5）對PCR產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從而獲得銹斑蟳遺傳變異的多態性圖譜。

2.根據權利要求1所述的一種銹斑蟳微衛星標記的快速檢測方法，其特征在于：所述步驟（1）中的提取銹斑蟳基因組DNA具體操作如下：剪取銹斑蟳肌肉組織100-150mg，置于500μl組織提取液中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K和終濃度為100μg/ml的RNase?A，55℃消化2-3個小時；用酚、氯仿、異戊醇按體積比25：24：1配成混合液抽提兩次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE緩沖液中；最后將DNA濃度稀釋為100ng/μl，并保存在-20℃備用。

3.根據權利要求2所述的一種銹斑蟳微衛星標記的快速檢測方法，其特征在于：所述的組織提取液具體組分為10mmol/L?Tris-Cl，pH8.0；100mmol/L?EDTA，pH8.0；100mmol/L?NaCl；0.5%SDS。

4.根據權利要求1所述的一種銹斑蟳微衛星標記的快速檢測方法，其特征在于：所述步驟（4）中的PCR擴增反應體系為25μl，包括基因組DNA模板1μl、終濃度均為0.4μmol/L的上下游引物、終濃度為1.5mmol/L?Mg²⁺、終濃度為0.2mmol/L?dNTP、0.75U?Tag?DNA聚合酶、1×PCRbuffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25μl；反應程序為：94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72℃延伸50秒，30個循環；最后于72℃延伸7分鐘。