[發明專利]單藍A作為蛋白質預染色劑的用途

有效

• 申請號: 201310210535.7
• 申請日: 2013-05-30
• 公開（公告）號: CN103308370A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 丁衛;竇云鵬;龔嘉玲;張晨光;鄭少鵬;油紅捷
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 北京康思博達知識產權代理事務所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及單藍A的新用途，尤其涉及單藍A作為蛋白質預染色劑的新用途，屬于單藍A的應用領域。

技術領域

蛋白質組學(proteomics)是指以基因組編碼的所有蛋白質為研究對象，從細胞水平及整體水平上研究蛋白質的組成及其變化規律，從而深入認識有機體的各種生理和病理。與傳統蛋白質研究比較，蛋白質組學研究體現了全面性、整體性、高通量、大規模的特點。蛋白質組學的研究對于已完成基因組計劃的理論預測的蛋白質組進行實證分析具有無法替代的重要作用，更重要的是蛋白質組分析無需依賴基因組研究，利用蛋白質研究有望從蛋白質的表達規律中找到序列分析難以處理的沒有任何同源序列的“孤兒”基因的生物功能線索，進而揭示出它在整個功能網絡的地位。蛋白質組學技術較為復雜，包括蛋白質分離、鑒定和信息分析三方面的內容。其中，凝膠電泳是與分離和鑒定相對應的核心技術之一。

自1959年Raymond和Weintraub首次使用聚丙烯酰胺作為電泳的支持介質，特別是20世紀60年代初Hjerten、Ornstein和Davis發表不連續電泳系統的基礎工作以來，聚丙烯酰胺凝膠已成為目前生化實驗最常用的支持介質，通過使用強陰離子SDS建立的SDS-PAGE技術已成為蛋白質分離、分析的常用方法。而在蛋白質組學試驗中，蛋白質經聚丙烯酰胺凝膠電泳后的染色是一個十分重要的環節。常用的蛋白質染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色等。其中，考馬斯亮藍（CBBR和CBBG）染色是最常用的蛋白質染色方法，它具有成本低、操作便捷及質譜兼容性好等特點。但是，考馬斯亮藍染色總體染色靈敏度還是較低，約為幾百納克到幾微克，染色時間較長，且凝膠背景偏深。銀染是目前公認的除了放射性標記以外最為靈敏的蛋白質檢測方法，可以在納克級水平上檢測蛋白。但是，銀染通常會有相對低的重復性，造成很高的背景，并且由于加入的戊二醛和甲醛會對蛋白質進行修飾，導致銀染的后續蛋白質組學研究的兼容性能普遍不佳。最近發展以來的熒光染色技術有很高的靈敏度和后續蛋白質組學研究兼容性。但由于熒光染料價格昂貴，切極易淬滅，還需要高端的儀器設備和特殊的分析軟件，限制了該項技術在蛋白質組學領域的廣泛應用。

Western-blot凝膠電泳是后續的蛋白質組學研究技術之一，其主要是用來識別、量化、并確定特定蛋白的大小。Western-blot是由Northern-blot和Southern-blot演化而來。在20世紀70年代后期，Towbin等人（1979年），使用聚丙烯酰胺-脲凝膠電泳分離蛋白質，并轉移到硝酸纖維素膜上。Burnette（1981年）使用應用廣泛的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質，這最終導致了這種方法被稱為Western印跡。它也被稱為蛋白質印跡或免疫印跡，并迅速成為蛋白質組學研究的有力工具。Western-blot的方法是先用凝膠電泳分離天然或變性的蛋白質，然后將蛋白質轉移到膜上，用未標記的特異性一抗與轉移到膜上的抗原結合，再加入標記（放射素、生物素等標記）的二抗進行雜交檢測，存在檢測步驟多、成本高等缺陷，有待改進。

發明內容

本發明目的之一是提供單藍A作為蛋白質預染色劑的新用途；

本發明目的之二是將用單藍A染色蛋白質的方法進行了優化；

本發明目的之三是提供了一種改進的蛋白質檢測方法；

本發明的目的之四是提供一種檢測蛋白在細胞內分布情況的方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

針對現有的蛋白質預染色劑或染色方法所存在的各種缺陷，本發明人進行了銳意研究，最終發現，單藍A可以作為蛋白質的預染色劑，用單藍A作為蛋白質的預染色劑，染色步驟簡便、染色所需時間短，15分鐘內可完成染色、染色所需染料的量少，染色后的蛋白產物可以肉眼直觀檢測也可以在近紅外激發光下被特殊掃描儀器檢測，從而完成了本發明。

本發明首先提供了單藍A作為蛋白質預染色劑的新用途；單藍A可以在蛋白質的標記或檢測等領域中有了多種用途，諸如：將標準量的蛋白質用單藍A染色后制作預染蛋白質分子量標準品(marker)以及質譜分析前端的目的蛋白篩選和鑒定等。

進一步的，本發明提供了用單藍A對蛋白質進行染色的方法，該方法包括：將單藍A溶液與待染色的蛋白質溶液混合進行染色反應，加入染色優化劑室溫靜置后再加入染色終止劑終止染色反應。

其中，單藍A與待染色的蛋白質的體積比優選為1:9。