[發(fā)明專利]一種羊胚胎活性肽的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310210475.9
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103265612A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設計）人: 張建湘;張李洋;唐岸柳;何國平
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 中南大學專利中心 43200
• 代理人: 胡奕

技術領域

本發(fā)明涉及生物活性物質的提取方法，具體涉及胚胎活性肽的提取方法。

背景技術

羊胚胎小分子生物活性肽，又名羊胎素，是胚胎細胞分化發(fā)育的調控原件，能使受精卵準確無誤地分化為各種組織細胞，能促進細胞分化與細胞增殖。小分子活性肽具有高度的保守性，其同源性很高，沒有免疫原性，不會出現(xiàn)過敏反應，對人體沒有副作用，可以為人類所利用小分子生物活性肽能直接進入細胞內修復受損細胞的DNA，保護與修復受損細胞，恢復受損細胞的結構與功能。因此，羊胚胎小分子生物活性肽能用于激活人體細胞活力、使老化細胞恢復細胞的結構與功能，保持細胞的活力狀態(tài)；并用于激活免疫細胞，能增強人體免疫細胞活力，使人體抗病能力增強。

目前，生物領域對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：酸堿制備法、鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、電泳等。

酸堿法制備生物活性肽工藝簡單，但是具有氨基酸受損嚴重，水解程度難以控制，副產物較多，影響肽的結構及功能，同時可能有酸、堿或其它物質殘留等缺點，故而限制了該方法的廣泛應用。酶解法使多肽和氨基酸損失較多，降低了活性肽的活性；且工序較為煩瑣，成本較高。其它方法提取小分子多肽主要是不能全部回收所需要活性肽，也很難達到規(guī)?；a的目的。

發(fā)明內容

針對目前羊胚胎生物活性肽提取技術中存在的各種不足，本發(fā)明的目地在于提供一種新的羊胚胎活性肽提取方法，該方法最大限度收集了多種生物活性肽成分，并最大限度的保持了羊胚胎生物活性肽的活性，且工藝又簡單環(huán)保。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明羊胚胎活性肽提取方法的詳細技術方案依次包括下列步驟：（1）．取6～16周羊胚胎新鮮組織，切碎后加入生理鹽水，經組織勻漿機勻漿；勻漿后快速凍融，即放入-20℃冰箱快速冷凍，30分鐘后取出，放入40℃水浴箱中快速融解；（2）．超聲裂解，每間隔30秒啟動超聲探頭，超聲持續(xù)時間15秒，重復3～5次；（3）．4℃低溫高速離心30分鐘，取上清液；（4）．將上清液用5k超濾膜離心超濾，澄清，得超濾液，即為羊胚胎活性肽溶液。

在步驟（1）中，勻漿后快速凍融可重復1～2次。

在步驟（2）超聲裂解時，超聲頻段最好設定為3000Hz。

在步驟（4）對上清液離心超濾時，最好控制流速為10～20ml/min。

上述制得的羊胚胎活性肽溶液還可以經進一步低溫冷凍干燥，獲得羊胚胎活性肽凍干粉。還可以根據(jù)需要，以羊胚胎活性肽溶液或凍干粉作為有效成分，用常規(guī)藥劑制備方法，加入常規(guī)的藥學載體各藥學輔料，如填充劑、粘合劑、崩解劑等，可以制備出各種藥學可接受形式的各種口服制劑，如顆粒劑、片劑和膠囊劑等。

?在本發(fā)明的工藝中，羊胚胎組織勻漿后在-20℃與40℃之間快速凍融及超聲裂解，能使細胞內天然小分子活性肽全部釋放出來；低溫高速離心能去除組織勻漿液中未能被超聲裂解所破碎的的雜質碎片；上清液經超濾后截留大分子蛋白質，millipore離心超濾澄清，截留分子量大于5kD的多肽或蛋白質，從而使濾液中活性肽分子量控制在5000D以下。

用本發(fā)明的方法提取的羊胚胎活性肽，經生物信息學分析，對胚胎活性肽的氨基酸序列、一級結構與功能進行比對分析，符合生物信息學中有關生物活性肽的特征。利用HPLC分析方法對提取物進行分析，得到多肽的質譜圖，測出該蛋白峰的分子量為3520道爾頓分子量分別為2039，2481，2929，3369，4300，4959道爾頓多個多肽分峰。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的具有如下明顯的優(yōu)點和效果：1.本發(fā)明的提取方法無需任何酸堿處理，從而有效的避免了化學方法處理帶來環(huán)境污染，也避免了對產品的污染。2.本方法最大限度收集了多種生物活性肽成分，活性肽的分子量有效的控制在5000D以下，最大限度地保持了羊胚胎小分子肽的生物活性。

說明書附圖

圖1是本發(fā)明實施例1制備的羊胚胎活性肽HPLC分析質譜圖；

圖2是HPLC分析24分鐘處洗脫的多肽的質譜圖；

圖3是HPLC分析27分鐘處洗脫的多肽成分的質譜圖；

圖4是小牛thymosin?α1標準經HPLC分析洗脫的多肽的質譜圖。?

具體實施方式