[發(fā)明專利]豬骨骼肌特異性表達(dá)基因tnnc2啟動子的克隆及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310210445.8
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103421789A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣思文;尚楊楊;柴進(jìn);張鳳;李倩倩;馬娟娟
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到豬骨骼肌特異性表達(dá)基因tnnc2的不同長度啟動子區(qū)域的分離鑒定及功能驗證。

背景技術(shù)

高等生物基因的表達(dá)受到細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的精細(xì)調(diào)控，因而具有嚴(yán)格的時間及空間有序性。基因的表達(dá)調(diào)控是一個復(fù)雜且有序的過程，由多階段調(diào)控水平共同完成，這主要包括轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后五個水平。其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。啟動子是轉(zhuǎn)錄水平上一個重要的調(diào)控元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，可與眾多的轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控基因的表達(dá)(武力1999)。因此深入研究啟動子的結(jié)構(gòu)、功能、作用模式等有利于我們更好的理解相應(yīng)基因的功能及基因間的互作關(guān)系。

啟動子分類方法較多，根據(jù)啟動子的功能及作用方式可以分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子；根據(jù)啟動子的結(jié)構(gòu)及位置可以分為核心啟動子、近端啟動子及遠(yuǎn)端啟動子(Wang?and?Hannenhalli2006；Reddy?et?al2003；Aneia?et?al2008)；根據(jù)核心啟動子的結(jié)構(gòu)又可以分為集中型啟動子和分散型啟動子。盡管啟動子的分類多種多樣，對于真核生物而言，RNA聚合酶II型啟動子起著主要作用(Sandelin?et?al2007)。在組織特異性啟動子調(diào)控的基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特征。具備高轉(zhuǎn)錄活性的組織特異性啟動子是基因工程中的理想啟動子，這類啟動子既能高效啟動外源基因表達(dá)，又能使外源基因在特定的靶細(xì)胞或靶組織中表達(dá)，這比現(xiàn)階段廣泛利用的CMV和SV40啟動子更具有研究和實用價值。

組織特異性啟動子通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理信號為基礎(chǔ)，可對外源基因進(jìn)行靶向定位，將基因固定于某一組織或細(xì)胞中表達(dá)，減少了機(jī)體能量和物質(zhì)的損耗及對機(jī)體代謝活動的影響，同時又能夠起到定向改善某一組織特性的效果，這在人類疾病治療方面的前景尤其可觀。其次，轉(zhuǎn)基因動物育種研究中，通過組織特異性啟動子調(diào)控外源目的基因在靶組織中表達(dá)，能夠有效改善動物的某些性狀，如肌內(nèi)脂肪；或改善動物的消化系統(tǒng)以減少排泄物中的氮磷含量等。鑒于此，組織特異性啟動子在基因工程和轉(zhuǎn)基因育種中越來越受到研究者的青睞。

快肌肌鈣蛋白C(TNNC2)是肌鈣蛋白C(TnC)一種異構(gòu)型。肌鈣蛋白C可通過本身具有的Ca²⁺結(jié)合位點，與Ca²⁺結(jié)合后引起肌肉收縮并釋放能量和CREB，CREB通過啟動核內(nèi)的c-myc和其他原癌基因單獨或協(xié)同調(diào)控肌蛋白的形成，從而開始肌纖維的生長分化。Gahlmann對人類的快肌肌鈣蛋白C和慢肌肌鈣蛋白C表達(dá)差異的研究發(fā)現(xiàn)，快肌肌鈣蛋白C基因僅在類似骨骼肌快肌的高纖維型肌肉中表達(dá)，而在慢肌和心肌中不表達(dá)(Gahlmann1988)。小鼠和人tnnc2基因研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者的編碼區(qū)長度部是480bp，編碼160個氨基酸，都擁有6個外顯子和5個內(nèi)含子(Tiso?et?al1997)。研究表明，豬tnnc2基因位于17號染色體，全長1143bp，含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼區(qū)長度為483bp，編碼160個氨基酸，通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)tnnc2基因僅在豬骨骼肌，如肱二頭肌、股四頭肌和背最長肌中表達(dá)，在其他組織不表達(dá)或者低表達(dá)(田興國2006)。

到目前為止，未見到研究豬骨骼肌特異性表達(dá)基因tnnc2的啟動子功能的相關(guān)報道。所以申請人對這個基因的啟動子進(jìn)行了不同長度片段的功能研究，以期能夠更好地利用該啟動子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于分離、篩選豬骨骼肌特異性表達(dá)基因tnnc2啟動子的不同片段，并對其進(jìn)行功能驗證，以期獲得此基因具備啟動活性并保持肌肉組織特異性的調(diào)控區(qū)段，為動物基因工程提供可利用的組織特異性啟動子。