[發(fā)明專利]用于抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌及其抗菌肽

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310210150.0
• 申請(qǐng)日: 2013-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN103589657A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾大興;吳小麗;賈書娟;張曉陽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A01P3/00;C07K1/30;C07K14/32;C12R1/125
• 代理公司: 深圳市維邦知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 44269
• 代理人: 黃莉

1.?一株枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?)C-D6，其保藏編號(hào)為：CGMCC?No.5345。

2.?如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌C-D6，在抑制辣椒炭疽菌附著胞形成方面的應(yīng)用。

3.?一種細(xì)菌培養(yǎng)液，包含權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其由以下步驟進(jìn)行培養(yǎng)而成：

1）斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株；

2）搖瓶培養(yǎng)：將斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)而得。

4.?如權(quán)利要求3所述細(xì)菌培養(yǎng)液，其特征在于：所述培養(yǎng)步驟1中，是從枯草芽孢桿菌C-D6的保藏菌種斜面劃線接種到NA平板，37℃培養(yǎng)20-24?h，挑起單菌落接種到NA試管斜面，37℃培養(yǎng)20-24?h后，備用。

5.?如權(quán)利要求3所述細(xì)菌培養(yǎng)液，其特征在于：所述培養(yǎng)步驟2中，是將C-D6菌株接種到裝有YPD液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃，180?r/min振蕩培養(yǎng)12?h后，按1%的接種量接種到相同培養(yǎng)瓶中，相同條件下震蕩培養(yǎng)48?h，從而獲得該細(xì)菌培養(yǎng)液。

6.?如權(quán)利要求3所述細(xì)菌培養(yǎng)液，其特征在于：所述YPD培養(yǎng)基組成成分為：酵母膏10?g/L，蛋白胨10?g/L，葡萄糖10?g/L，pH?7.0~7.2。

7.?一種抗菌蛋白，是由權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌由以下分離純化方法獲得，該分離純化方法包括如下步驟：

1）枯草芽孢桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液的準(zhǔn)備；?

2）硫酸銨沉淀分離：細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)20%飽和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，離心沉淀蛋白，所得蛋白質(zhì)沉淀用磷酸緩沖液懸浮，并用相同緩沖液透析48h后，離心棄沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；?

3）抗菌蛋白純化：采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對(duì)蛋白粗提液進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

8.?如權(quán)利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液的準(zhǔn)備進(jìn)一步是由以下步驟獲得：

1）斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株；

2）搖瓶培養(yǎng)：將斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)而得；所述YPD培養(yǎng)基組成成分為：酵母膏10?g/L，蛋白胨10?g/L，葡萄糖10?g/L，pH?7.0~7.2。

9.?如權(quán)利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于：分離純化方法的步驟2具體為：所述經(jīng)20%飽和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，離心收集沉淀蛋白，所得蛋白質(zhì)沉淀用原體積1/15的磷酸緩沖液懸浮，并用相同緩沖液透析48h后，離心棄沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；所述純化方法的步驟3具體為：以Sephadex?G-75凝膠柱為分離柱，上樣量為5?mL，流動(dòng)相為50mmol/L?pH?6.0的磷酸緩沖溶液，洗脫速度為0.5?mL/min，洗脫1.2倍柱體積；Sephadex?G-75柱層析分離獲得的活性產(chǎn)物通過陰離子交換層析Q-Fastflow進(jìn)一步純化，獲得純化活性蛋白；所述Q-Fastflow的分離條件為：流動(dòng)相A：0.01mM?磷酸緩沖液（PB），pH?7.4；流動(dòng)相B：1M?NaCl洗脫液（含流動(dòng)相A）；洗脫方式：線性梯度洗脫；洗脫時(shí)間：110min；洗脫速度：1mL/min；上樣量：2mL/min。