[發明專利]制備高活性茶皂甙的生物轉化方法

無效

• 申請號: 201310207950.7
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN103266154A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 田晶;王秀英;費旭;徐龍權;王一
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12R1/685;C12R1/69
• 代理公司: 大連星海專利事務所 21208
• 代理人: 花向陽

1.一種制備高活性茶皂甙的生物轉化方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）利用AB-8大孔樹脂對粗茶皂甙的純化：

將從油茶餅中提取到的粗茶皂甙用質量濃度為70～95%乙醇溶液浸泡，過濾得清液，50～75℃減壓蒸出乙醇，得到油茶皂甙的清液，清液上AB-8大孔樹脂柱，靜置使充分吸附，依次用去離子水、0.1%NaOH水溶液以1.5BV/h速度沖洗，再用去離子水洗至洗滌液pH＝7-8，用乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，50～75℃減壓濃縮至干，獲得純化后茶皂甙；

（2）茶皂甙酶解底物的制備：

將純化后的茶皂甙放入瓷碗中，加入甲醇使其溶解，且茶皂甙濃度為3-8mg/mL，向該溶液中加入質量為茶皂甙質量5-10倍的100～200目硅膠，攪拌均勻，置水浴鍋上加熱至65-80℃，待溶劑揮發完全后制得樣品膠；

在層析柱中加入質量為茶皂甙質量30-300倍的300～400目的硅膠，保持上表面水平，抽真空使之細密均勻，再裝入干燥好的樣品膠；

硅膠柱裝好后，先用純氯仿通柱，再依次按體積比氯仿:甲醇=9:1、8:2、7:3、6:4、5:5梯度洗脫茶皂甙，分別收集洗脫液，并對收集到的產物進行分析，得到茶皂甙酶解底物－茶皂甙A₅，其化學名稱為3-氧-β-D-吡喃半乳糖基-(1-2)[β-D-吡喃葡萄糖基-(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基(1-3)]β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-21-氧-當歸酸基-28-氧-乙酰基-茶皂甙元A；

（3）酶液的提取：

將豆粕攪碎，過20目篩，分別稱取豆粕和麥麩，使二者的重量比為1：3，放入錐形瓶中，加入自來水使濕潤，每g混合物加入1mL自來水，攪拌均勻，在121℃下滅菌15～20分鐘，待冷卻后，接入曲霉菌，于25～40℃下培養2～5天，待長出大量孢子后，向培養基中加入0.02mol/L、pH值為5.0的NaAc-HAc緩沖液，緩沖液體積為前述自來水體積的5倍，浸泡1～2小時，用紗布過濾，濾液在9000轉/分轉速下離心15分鐘，除去其中部分雜質，即得到酶液，在酶液中緩慢加入無水乙醇，使乙醇濃度為70%～75%，于2～8℃放置過夜，進行鹽析，鹽析后的酶液在8000-10000轉/分轉速下離心10-20分鐘，將沉淀用1-3mL上述緩沖液洗下，置于透析袋中用醋酸緩沖液于2～8℃透析24-48小時，之后再離心，所得上清液即為酶液；

（4）茶皂甙的酶解：

將相同體積的0.5～5.0mg/mL的步驟（2）得到的茶皂甙A₅溶液和步驟（3）得到的酶液混和均勻，使pH值為4.0～6.0，40～55℃反應10～20小時，反應終止時，向反應體系中加入2倍體積茶皂甙A₅溶液的正丁醇搖晃多次，靜置分層后，取出上層液，將正丁醇蒸干，即得酶解產物；

（5）酶解組分的分離：

采用1mm厚的硅膠制備層析板，按照薄層層析的方法和要求，分離步驟（4）得到的酶解產物，酶解產物用甲醇溶解成0.5～5.0mg/mL溶液進行點樣，展開劑是：氯仿:甲醇:水=7:3:0.5，確定目標產物在層析板上的位置為Rf=0.67，用刀片刮下該位置的硅膠，再用1-5mL甲醇將其溶解，過濾，將濾液濃縮后得到酶解后的皂甙產物A₆，其化學名稱為3-氧-[β-D-吡喃半乳糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-21-氧-當歸酸基-28-氧-乙酰基-茶皂甙元A。

2.根據權利要求1所述的制備高活性茶皂甙的生物轉化方法，其特征在于：所述曲霉菌從黑曲霉菌sp.48、黑曲霉菌sp.92、黑曲霉菌sp.848、黑曲霉菌sp.3112、黑曲霉菌sp.3111、黑曲霉菌sp.uv-11、米曲霉菌sp.39、米曲霉菌sp.42、米曲霉菌sp.00、米曲霉菌sp.3102中選取一種。