[發明專利]一種北五味子人工種子制備和育苗方法

有效

• 申請號: 201310207635.4
• 申請日: 2013-05-30
• 公開（公告）號: CN103299904A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 于繼鴻
• 申請（專利權）人: 遼寧萬畝五味子科技產業園區有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G1/00
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種北五味子人工種子的制備和育苗方法。

背景技術

北五味子為東北地區道地藥材，其中又以遼寧省產量最大，質量最佳，但目前幾乎所有的五味子種植基地中均存在嚴重的品種混雜現象，主要體現在果實顏色、果穗形狀、產量、有效成分含量、葉片質地和大小等方面的差異，該現象造成了五味子藥材品質嚴重參差不齊的現象。目前，五味子栽培基地中所使用的繁殖方法均為種子繁殖，但該方法不可避免地會造成生殖分離與農藝性狀退化等問題，即使通過取樣得到了品質和產量均較優的五味子品系，但通過種子繁殖得到的子代中又會出現母代品質差異較大的現象，此外，種子育苗還存在過程繁瑣，有嚴格的時間限制等缺點。因此，有必要對五味子進行無性繁殖研究。

已有專利CN101904302A和CN1817106公開了一種五味子體細胞胚的誘導方法，將得到的體細胞胚在無菌條件下進行萌發得到五味子種苗，該方法繁殖系數較高，所需原材料較少，但是該方法中，得到組培苗的全過程均是在無菌條件下進行的，操作周期長，勞動強度大，這就大大提高了種苗繁育過程所投入的人力物力，提高了其繁育和栽培面積擴大化的成本。

已有專利CN101485293和CN101878737A公開了一種五味子種苗繁育的方法，即通過組織培養技術誘導得到叢生芽，再將叢生芽進行生根處理，最后將生根后的五味子種苗移栽到田間。該方法具有技術難度低，成功率高的優點，但是繁殖系數低，繁殖速度慢，無菌操作過程長，勞動強度高，也需要耗費大量人力物力。因此有待于開發一種具有繁殖系數高，人力物力需求少，繁殖速度快，萌發率高，成活率高的制備方法，以克服現有技術的缺陷。

發明內容

本發明所解決的技術問題是：提供一種能夠在有菌栽培基質中正常萌發的五味子人工種子，該人工種子可由下述過程制備獲得：將五味子外植體進行表面消毒，接種到愈傷組織誘導培養基中得到愈傷組織，將愈傷組織在液體培養條件下建立懸浮培養體系，進行胚型愈傷組織的誘導，將胚型愈傷組織進行體細胞胚誘導，將誘導得到的體細胞胚接種到1/2MS培養基中進行同步化培養，將子葉期體細胞胚重懸于含有殼寡糖200-1000mg/L、0.1～0.5％活性炭、0.5-2％木薯淀粉、海藻酸鈉2-5％的1/2MS培養基中(其中各組分的百分比濃度均為重量體積百分濃度)。然后經離子交換過程形成海藻酸鈉-CaCl₂水凝膠小球，將得到的凝膠小球與脫乙酰殼聚糖和多菌靈微粉進行反應，即可得到包裹有脫乙酰殼聚糖和多菌靈微粉人工種皮的人工種子；將此人工種子在人工栽培基質(泥炭土與土壤混合物)中按照一定的栽培條件進行萌發，即可得到快繁種苗。

本發明提供了一種五味子人工種子的制備和種苗繁育方法，該方法包括下述順序的步驟：

(1)以良種五味子外植體為起始材料，經75％酒精和飽和次氯酸鈉溶液依次表面消毒后，切成小塊，在超凈工作臺內接種到含有2，4-二氯苯氧乙酸0.5～2mg/L，6-芐氨基嘌呤1.0～3.0mg/L，蔗糖15～30g/L，瓊脂0.5～1％，最終pH調至5.5～6.5之間的無菌MS固體培養基(愈傷組織誘導培養基)中，于25±1℃、暗培養條件下進行愈傷組織的誘導。

(2)選取淡黃綠色，質地疏松，生長旺盛的愈傷組織，接種到除去瓊脂的愈傷組織誘導培養基中，建立其懸浮培養條件，得到旺盛生長，大小均勻的細胞懸液。

(3)在得到足夠量的細胞懸液后，將其在無菌條件下過濾得到細胞，用除去激素的MS培養基洗滌后，接種于含有0.2～2.0mg/L噻重氮苯基脲和0.5～3mg/L脫落酸的MS培養基中，進行體細胞胚的誘導。

(4)將得到的體細胞胚用不同目數的篩網過濾，得到大小相近的體細胞胚，再將體細胞胚接種到去除了磷元素的1/2MS液體培養基中處理2～7天，進行體細胞胚的同步化，然后再進行正常培養，當有70％以上體細胞胚處于子葉胚階段時，即可進行包埋處理。

(5)將同步化后的體細胞胚懸浮于含有殼寡糖200-1000mg/L、0.5-2％木薯淀粉、0.1～0.5％活性炭、海藻酸鈉2-5％的1/2MS培養基中，將上述懸液滴至10～20％的氯化鈣溶液中，離子交換時間為10分鐘，控制液滴大小，使每滴中含有1個最多2個體細胞胚，將得到的凝膠小球用蒸餾水略洗滌。

(6)將得到的凝膠小球在脫乙酰殼聚糖和多菌靈混合微粉中進行包被，混合比例1∶1～4∶1，即可得到具有抗菌特性和一定韌度的人工種皮，至此，五味子人工種子制備完成。