[發明專利]新型抗VEGFR2的單克隆抗體及其制備與應用

有效

• 申請號: 201310207137.X
• 申請日: 2013-05-30
• 公開（公告）號: CN103333247A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 朱曉東;谷香果;李先鐘;高燕;牛德云;蔡清華;岳玲;白義;白先宏
• 申請（專利權）人: 北京東方百泰生物科技有限公司;北京精益泰翔技術發展有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/63;C12N5/10;A61K39/395;A61P35/00;A61P35/04
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技術領域

本發明涉及一種新型的抗VEGFR2的單克隆抗體及其制備與用途，屬于生物工程技術領域。

背景技術

血管生成是指已存的血管(毛細血管和小靜脈)通過出芽或分裂的方式產生新的血管，生理與病理條件下，如胚胎發生，女性生殖周期，炎癥反應，傷口愈合，腫瘤發生等過程都進行著血管生成。1971年，Folkman首先建立了血管生成和腫瘤生長之間的聯系，發現許多腫瘤如果不進行血管生成，只能長到幾毫米大小，若抑制血管生成，腫瘤細胞雖仍在高速增殖，但同時進行著快速的細胞凋亡，新生血管處于刺激劑與拮抗劑的平衡之中。抑制腫瘤血管生成，可抑制腫瘤的生成與轉移，這在許多臨床試驗中得到證實。抗腫瘤血管生成療法(tumor?anti-angiogenesis?therapy)比較其它腫瘤治療方法有許多優勢，如很少產生耐藥性，副作用小，效率高。

抑制腫瘤血管生成的較好靶位點是腫瘤內皮細胞，通過封閉其表面的促血管生成因子的受體，誘導內皮細胞凋亡，抑制內皮細胞的生長遷移，可高效地破壞新生血管形成。血管內皮生長因子(VEGF)是已知最重要的血管生成因子，是內皮細胞高度特異的促有絲分裂原和促血管通透性因子。已被鑒定的相應受體為VEGFR-1(Flt-1，fms樣酪氨酸激酶)，VEGFR-2(又稱為KDR/Flk-1，激酶插入嵌合受體、胎肝激酶-1)，VEGFR-3(Flt-4)，神經纖維蛋白-1(neuropilin-1)，神經纖維蛋白-2。VEGFR2是血管內皮細胞上的主要VEGF受體，為糖蛋白，胞外區含有七個免疫球蛋白樣區(含配體結合域和受體二聚化結構域)，胞內插入了酪氨酸激酶催化結構域，主要在內皮細胞上表達，其它如巨核細胞、視網膜遠祖細胞、間充質干細胞，一些腫瘤細胞如黑色素瘤細胞、腦瘤和某些白血病細胞等。VEGF和VEGFR2受體作為關鍵的血管內皮細胞特異因子信號傳導途徑分子參與腫瘤新生血管的建成。VEGF的主要生物學功能都是通過VEGFR2實現的。VEGFR2和VEGF結合后發生二聚體化，并且胞內的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而激活并將細胞膜/細胞質激酶級聯反應信號傳遞到細胞核。可引發內皮細胞的一系列變化，包括血管內皮細胞增殖、存活、細胞骨架重排、細胞遷移以及基因表達等，并最終引起血管增生。通過封閉此信號途徑的抗體，小分子化合物已經找到很多，臨床試驗表現了良好的治療效果。

噬菌體抗體庫技術是在噬菌體展示基礎上發展起來的，是迄今為止發展最成熟、應用最廣泛的抗體庫技術。使用該技術已經陸續構建成功免疫抗體庫、大然抗體庫、半合成抗體庫和全合成抗體庫，也用于篩選出高特異的功能性抗體和改進抗體的品質。噬菌體表面展示是一種基因表達篩選技術，即將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達，展示在噬菌體顆粒的表面。這樣外源蛋白或多肽的基因型和表現型統一在同一噬菌體顆粒內，通過表型篩選就可以獲得其編碼基因。經研究發現，外源蛋白在P3和P8蛋白的N末端融合表達不會影響噬菌體的完整性和活性。按照展示在噬菌體顆粒表面的抗體片段種類的不同，噬菌體抗體庫主要有scFv抗體庫和Fab抗體庫兩種。Fab抗體僅包括VHCH1和VK?CK(或VL?CL)，scFv是抗體的VH和VK(或VL)通過linker連接成的小分子抗體。Fab和scFv分子小，結構簡單，易于穿過組織，表達效率高，有利于腫瘤等疾病的治療。但這兩種形式也分別具有各自的特點，Fab含有兩條鏈，具有難組裝、產量低的缺點；scFv的主要問題是易于形成二聚體，但是較易合成，耐受性好。

建立噬菌體抗體庫的目的是為了有效的獲得針對各種抗原的人源抗體。噬菌體抗體庫技術的最大優點是直接將表達型與其基因型聯系在一起，再利用其配體的特異性親和力，將所感興趣的蛋白質或多肽挑選出來，主要包括以下幾個方面：

1)該技術不經免疫，繞過雜交瘤技術，省時省力，省去了細胞融合的步驟，避免了因雜交瘤不穩定而需要反復亞克隆的繁瑣程序。

2)擴大了篩選容量，用雜交瘤技術一般篩選能力在上千個克隆以內，而抗體庫可篩選10⁶以上個克隆。

3)抗體庫技術直接克隆到抗體的基因，既免去了雜交瘤分泌抗體不穩定之虞，又便于進一步構建各種類型的基因工程抗體，抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性。

4)對于一些難于制備的抗體，如針對弱免疫原、毒性抗原的抗體，人源抗體等的制備可以得到解決。