[發明專利]通過結直腸癌免疫學指標CD8陽性表達量對結直腸癌患者的預后進行評價的方法

無效

• 申請號: 201310206359.X
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN103267849A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 崔龍;王光輝;劉辰瑩;劉云;吳庭玉;梁中林
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬新華醫院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 吳寶根

1.一種通過結直腸癌免疫學指標CD8陽性表達量對結直腸癌患者的預后進行評價的方法，其特征在于具體包括如下步驟：

（1）、首先，將手術切除的64-180個結直腸癌腫瘤組織標本進行石蠟包埋，制成組織蠟塊；

（2）、然后，根據HE染色確定步驟（1）所得的蠟塊中腫瘤組織的位置，選取其中的腫瘤組織的中央部位制成含有64-180個點位的組織芯片；

（3）、接著，對步驟（2）所得的組織芯片、陽性對照和陰性對照進行免疫組織化學染色；

其中所述的陽性對照使用已證實為陽性組織的腫瘤細胞組織制成的組織芯片；

所述的陰性對照使用相同的組織芯片；

（4）、組織芯片常規脫蠟、水化；

（5）、微波抗原修復；

（6）、滅活內源性過氧化物酶；

（7）、封閉非特異性蛋白；

（8）、滴加一抗

CD8一抗用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀釋，至于濕盒里4℃孵育過夜；

陰性對照中以PBS緩沖液代替一抗；

（9）、復溫45分鐘；

（10）、滴加二抗；

（11）、DAB顯色；

（12）、蘇木素復染；

（13）、脫水和透明；

（14）、封片；

（15）、結果分析：

陽性信號為棕黃色顆粒，用Olympus光學顯微鏡在200倍放大倍數下，對上述所得的每個組織位點拍攝兩張圖片，計數圖片中陽性染色細胞的數目；

若陽性染色細胞數為0個，則免疫評分為0分；

若陽性染色細胞數為1-19個，則免疫評分為1分；

若陽性染色細胞數為20-49個，則免疫評分為2分；

若陽性染色細胞數大于49個，則免疫評分為3分；

（16）、根據步驟（15）所得的免疫評分進行分組，免疫評分為0、1的歸為一組即為CD8陽性表達量低的一組，免疫評分為2、3的歸為一組即為CD8陽性表達量高的一組；

（17）、利用Graph?Pad?prism?5作圖軟件，將步驟（16）中CD8陽性表達量低的一組和CD8陽性表達量高的一組的隨訪得到的患者生存期作為橫坐標，將患者的總生存率作為縱坐標進行作圖，根據所得的圖形生存期和總生存率的關系進行分析來判定CD8陽性表達量與結直腸癌患者的預后效果。

2.如權利要求1所述的一種通過結直腸癌免疫學指標CD8陽性表達量對結直腸癌患者的預后進行評價的方法，其特征在于步驟（5）所述的微波抗原修復，即將組織切片浸于由檸檬酸鈉、檸檬酸三鈉和純水配制的抗原修復液中，于微波爐中高火檔加熱3分鐘，然后中低火檔加熱4分鐘×2次，取出后室溫下冷卻，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘×3次。

3.如權利要求2所述的一種通過結直腸癌免疫學指標CD8陽性表達量對結直腸癌患者的預后進行評價的方法，其特征在于步驟（6）所述的滅活內源性過氧化物酶，即用30%過氧化氫和甲醇配成的滅活液，將組織切片浸泡在滅活液中30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶后，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘×3次。

4.如權利要求3所述的一種通過結直腸癌免疫學指標CD8陽性表達量對結直腸癌患者的預后進行評價的方法，其特征在于步驟（7）所述的封閉非特異性蛋白即將組織切片擦洗干凈，在每張組織切片上滴加50微升的封閉液即5%的BSA水溶液，孵育30分鐘，封閉非特異性抗原。

5.如權利要求4所述的一種通過結直腸癌免疫學指標CD8陽性表達量對結直腸癌患者的預后進行評價的方法，其特征在于步驟（10）所述的滴加二抗即將切片置入濕盒中，用濾紙將組織周圍的水分吸去，每張組織切片滴加抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒中的A液即辣根過氧化物酶聚合物一滴，室溫下孵育半小時。

6.如權利要求5所述的一種通過結直腸癌免疫學指標CD8陽性表達量對結直腸癌患者的預后進行評價的方法，其特征在于步驟（11）所述的DAB顯色，即將抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒中的B液即DAB原液和C液即DBA緩沖液按照B液:C液為1：50的比例配置成顯色液，每張組織切片加入70ul的顯色液，在顯微鏡下控制顯色時間，觀察到出現陽性結果又無明顯背景著色時中止反應，用蒸餾水沖洗10分鐘。