[發(fā)明專利]通過結(jié)直腸癌免疫學(xué)指標(biāo)CD3陽性表達(dá)量對結(jié)直腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行評價(jià)的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310206356.6
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN103257229A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔龍;王光輝;劉辰瑩;劉云;吳庭玉;梁中林
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 吳寶根

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種結(jié)直腸癌免疫學(xué)指標(biāo)預(yù)后評價(jià)的方法。具體涉及一種通過結(jié)直腸癌免疫學(xué)指標(biāo)CD3陽性表達(dá)量對結(jié)直腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行評價(jià)的方法。

背景技術(shù)

法國的國家衛(wèi)生醫(yī)藥研究院的Jerome?Galon等2006年發(fā)表于science雜志的一項(xiàng)研究提示T細(xì)胞浸潤部位、類型及程度是結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，而CD8+細(xì)胞在腫瘤組織中央和邊緣的浸潤程度對于預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性達(dá)到65.3%，高于TNM分期的50-60%，并且ROC曲線提示免疫學(xué)評分在臨床具有更好的可操作性。他們建立了以CD8+和CD45RO+細(xì)胞數(shù)量和浸潤位置為基礎(chǔ)的一套結(jié)直腸癌腫瘤免疫環(huán)境評分標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤兩個(gè)部位浸潤的CD8+和CD45RO+細(xì)胞數(shù)量都少為0分，腫瘤兩個(gè)部位浸潤的CD8+和CD45RO+細(xì)胞數(shù)量都多為4分，免疫評分為4分的病例組里只有4.8%的患者復(fù)發(fā)，五年生存率達(dá)到86.2%，而免疫評分為0分和1分的病例組里有72%的患者復(fù)發(fā)，五年生存率只有27.5%，此后結(jié)直腸癌的免疫細(xì)胞浸潤與預(yù)后評判作用引起廣泛關(guān)注。

目前可以提供準(zhǔn)確可靠的結(jié)直腸癌患者預(yù)后信息的分子靶標(biāo)非常少，1998-2012年間國外文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于結(jié)直腸癌免疫學(xué)指標(biāo)預(yù)后評價(jià)作用的研究有26個(gè)之多，評判標(biāo)準(zhǔn)也雜亂不齊，因而一直沒有規(guī)范研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決上述的評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后評價(jià)的缺陷而提供一種通過結(jié)直腸癌免疫學(xué)指標(biāo)CD3陽性表達(dá)量對結(jié)直腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行評價(jià)的方法，即先通過CD3陽性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行免疫評分，然后通過CD3陽性表達(dá)量確定與患者預(yù)后的關(guān)系。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種通過結(jié)直腸癌免疫學(xué)指標(biāo)CD3陽性表達(dá)量對結(jié)直腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行評價(jià)的方法，具體包括如下步驟：

（1）、首先，將手術(shù)切除的64-180個(gè)結(jié)直腸癌腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，制成組織蠟塊；

（2）、然后，根據(jù)HE染色確定步驟（1）所得的蠟塊中腫瘤組織的位置，選取其中的腫瘤組織的中央部位制成含有64-180個(gè)點(diǎn)位的組織芯片；

（3）、接著，對步驟（2）所得的組織芯片、陽性對照和陰性對照進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（王光輝2013年Identification?of?MXRA5?as?a?novel?tissue?biomarker?for?colorectal?cancer?progression）；

其中陽性對照使用已證實(shí)為陽性組織的腫瘤細(xì)胞組織制成的組織芯片；

陰性對照使用相同的組織芯片；

（4）、組織芯片常規(guī)脫蠟、水化；

（5）、微波抗原修復(fù)；

將組織切片浸于由檸檬酸鈉、檸檬酸三鈉和純水配制的抗原修復(fù)液中，于微波爐中高火檔加熱3分鐘，然后中低火檔加熱4分鐘×2次，取出后室溫下冷卻，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘×3次；

（6）、滅活內(nèi)源性過氧化物酶：

用30%過氧化氫和甲醇配成的滅活液，將組織切片浸泡在滅活液中30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘×3次；

（7）、封閉非特異性蛋白：

將組織切片擦洗干凈，在每張組織切片上滴加50微升的封閉液即5%的BSA水溶液，孵育30分鐘，封閉非特異性抗原；

（8）、滴加一抗：

CD3一抗（YH112318，EPITOMICS）用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀釋，至于濕盒里4℃孵育過夜；陰性對照以PBS緩沖液代替一抗；

（9）、復(fù)溫45分鐘；

（10）、滴加二抗

抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒即以下簡稱二抗試劑盒，將切片置入濕盒中，用濾紙將組織周圍的水分吸去，每張組織切片滴加二抗試劑盒中的A液即辣根過氧化物酶聚合物一滴，室溫下孵育半小時(shí)；

（11）、DAB顯色：

二抗試劑盒即中的B液即DAB原液和C液即DBA緩沖液按照B液:C液為1：50的比例配置成顯色液，每張組織切片加入70ul的顯色液，在顯微鏡下控制顯色時(shí)間，觀察到出現(xiàn)陽性結(jié)果又無明顯背景著色時(shí)中止反應(yīng)，用蒸餾水沖洗10分鐘；

（12）、蘇木素復(fù)染；

（13）、脫水和透明；

（14）、封片；

（15）、結(jié)果分析：