[發明專利]一種RNA的免洗滌預備模板PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201310205271.6
• 申請日: 2013-05-28
• 公開（公告）號: CN103333954A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 陳燃;金曉錚
• 申請（專利權）人: 浙江今復康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種RNA的免洗滌預備模板PCR檢測方法。

（二）背景技術

RT-PCR（Reverse?Transcription?Polymerase?Chain?Reaction，逆轉錄-聚合酶鏈反應），是將逆轉錄反應（Reverse?Transcription，RT）和PCR（Polymerase?Chain?Reaction）反應組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成，即RT，同PCR擴增結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RNA的RT-PCR檢測或定量分析，比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作，已發展成為進行基因表達水平的檢測分析，病原體的檢測分析等有力的手段。但是RT-PCR在應用中也碰到一些問題，如：對RNA樣品的純度要求較高——不僅要求除去蛋白質等非核酸類的物質，還要求除去DNA，以避免DNA的干擾；由于操作步驟多操作時間長，需要特別小心地防止RNA在操作過程中的降解；由于2種酶促反應（RT和PCR）的最優反應條件是有差異的，不容易找到一個優化的平衡點；這些都導致操作步驟繁瑣，操作要求高，容易受到各種抑制物質的影響，也容易受到非特異擴增和假陽性的困擾，另外，逆轉錄酶的價格一直居高不下，方法的實現成本很難降下來。歸納起來，就是偏難偏貴偏麻煩，造成了臨床普及的障礙。

預備模板PCR（Template-Ready?PCR，TRPCR），是申請人近期推出的RNA?PCR檢測方法（CN102864233A）。該方法通過一個錨定探針特異結合目標RNA，同時將另一個與目標RNA結合的模板探針吸附固定在反應管中，通過多次洗滌的步驟，除去未結合的RNA及其他各種物質，最后加入PCR反應體系對模板探針進行PCR擴增，結果反映了目標RNA的存在。該方法與傳統的RT-PCR方法相比，不需要純化抽提RNA，不需要進行逆轉錄反應，將原本長達3個小時以上的PCR前處理過程縮短為約50分鐘，因此，操作簡便快速易行，具有良好的RNA檢測的靈敏度和特異性，適合對各種來源的樣品裂解得到RNA進行檢測。在實際應用中，發明人發現TRPCR過程的多次洗滌步驟仍然比較繁瑣，模板探針與目標RNA結合的溫度控制要求較高，且受環境溫度變化的影響，若室溫過低，則容易導致非特異的結合，造成假陽性，這些給結果造成了不穩定不一致的因素。因此發明人重新設計通過引入對雙鏈DNA特異的酶切反應，對TRPCR進行了重大的革新改進。

（三）發明內容

一種操作簡單快速、特異性強的RNA的免洗滌預備模板PCR檢測方法。

本發明采用的技術方案是：

一種RNA的免洗滌預備模板PCR檢測方法，所述方法包括：

（1）設計合成與目標RNA上任意一段序列互補的長度為25～50mer的單鏈寡核苷酸DNA，記為探針A；探針A的GC含量為40～60%，解鏈溫度（Tm值）為75～85℃；將探針A錨定在PCR管內，得到錨定PCR管；探針A的固定可以采用本領域常規方法進行，用于結合錨定探針A的固體介質，可以是塑料離心管，也可以是磁珠，凝膠顆?；蚱渌梢晕浇Y合核酸的固體介質；所述探針A優先為生物素化的探針A，即生物素在合成時直接修飾加在5’端；具體的，錨定PCR管的制備方法可如下：TBST緩沖液20ul，含有5pmol生物素化的錨定探針A，裝入鏈霉親和素包被的0.2ml?PCR薄壁管中，室溫1hr，吸干管內液體，加100ul?TBST緩沖液，打勻，吸干，如此反復洗滌共3次，最后吸干；加100ul?TE緩沖液，然后，吸干管內液體，密封后放置于-20℃備用。

（2）設計合成部分序列與目標RNA上另一段含有限制性內切酶識別位點的任意序列互補的長度為70～100mer的單鏈寡核苷酸DNA，其結構為:中間長度為25～50mer與目標RNA上含有限制性內切酶識別位點的區域（區域2）完全互補的序列，兩端為長度20～30mer的PCR引物序列，記為探針B；探針B的GC含量為40～60%，解鏈溫度為75～85℃，與探針A和目標RNA的結合區域互不重疊；所述的限制性內切酶的特性為，不能切割RNA/DNA雜合雙鏈，在PCR體系中37℃下保持對雙鏈DNA的特異酶切活性，在≥55℃下失去活性，例如PstI、BamHI、EcoRI、HindIII、AvaI、MboI等。