[發(fā)明專(zhuān)利]肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310205059.X
• 申請(qǐng)日: 2013-05-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104212760B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡蘋(píng);傅鑫;肖俊;郭恒江;李升;劉燕;王紅艷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/074
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/074;A61K35/34;A61P21/00
• 代理公司: 上海光華專(zhuān)利事務(wù)所31219
• 代理人: 許亦琳,余明偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及肌肉干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞治療領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肌肉干細(xì)胞負(fù)責(zé)出生后肌肉組織的生長(zhǎng)和再生，且肌肉干細(xì)胞在體內(nèi)沒(méi)有致癌效果，不存在應(yīng)用胚胎干細(xì)胞時(shí)會(huì)碰到的倫理問(wèn)題，因而在肌肉萎縮和重癥肌無(wú)力等各種肌肉退行性疾病的治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。肌肉干細(xì)胞臨床應(yīng)用的一個(gè)重要障礙是無(wú)法在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)肌肉干細(xì)胞。和大多數(shù)成體干細(xì)胞一樣，肌肉干細(xì)胞從體內(nèi)分離之后，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中只能再分裂2-4次，幾乎無(wú)法傳代。

現(xiàn)有培養(yǎng)肌肉干細(xì)胞（衛(wèi)星細(xì)胞）的方法幾乎都來(lái)源于Bischoff博士在1986年建立的方法，后經(jīng)過(guò)Beauchamp等人的改進(jìn)，形成現(xiàn)有的在F10基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10ng/ml FGF進(jìn)行培養(yǎng)的方法。在此培養(yǎng)條件下，肌肉干細(xì)胞可以增殖3-5次。在傳代時(shí)，肌肉干細(xì)胞會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)嚴(yán)重的危機(jī)時(shí)期，在這一危機(jī)時(shí)期，絕大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)死去，殘留的細(xì)胞則分化為不具有干性的前體細(xì)胞。所以體外培養(yǎng)1-3代（3-12天）后，分離得到的肌肉干細(xì)胞即全部分化為不具有干性的前體細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞的分子標(biāo)記在這些前體細(xì)胞中都無(wú)法檢測(cè)到。注射入小鼠體內(nèi)后，這些前體細(xì)胞參與肌肉損傷修復(fù)的能力非常弱，不能在體內(nèi)形成有功能的干細(xì)胞，完全不能進(jìn)行移植后二次損傷的修復(fù)。（Bischoff R.A satellite cell mitogen from crushed adult muscle.Dev Biol.,1986.115(1):140-147.Beauchamp,J.R.,et al.,Expression of CD34and Myf5defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells.J Cell Biol,2000.151(6):p.1221-34.）也就是說(shuō)，采用現(xiàn)有的肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)后的肌肉干細(xì)胞傳代后要經(jīng)過(guò)一個(gè)危機(jī)期，危機(jī)期后得到的可以增殖的細(xì)胞絕大多數(shù)已經(jīng)分化為肌肉祖細(xì)胞，喪失了肌肉損傷修復(fù)的能力。由于這一問(wèn)題的存在，使得通過(guò)在肌肉干細(xì)胞中進(jìn)行基因修復(fù)治療遺傳性的肌肉退行性疾病的方法難以在臨床治療中使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

本發(fā)明第一方面提供了一種肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為采用添加有血液細(xì)胞的細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)基或血液細(xì)胞的條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)肌肉干細(xì)胞。本發(fā)明的肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法適合體外長(zhǎng)期培養(yǎng)肌肉干細(xì)胞。

本發(fā)明第二方面提供了一種肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)基，為添加有血液細(xì)胞的細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)基或血液細(xì)胞條件培養(yǎng)基。

所述添加有血液細(xì)胞的細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)基中所添加的血液細(xì)胞的細(xì)胞因子，用于制備所述血液細(xì)胞條件培養(yǎng)基的血液細(xì)胞，均與待培養(yǎng)的肌肉干細(xì)胞來(lái)源于相同的動(dòng)物物種。

當(dāng)添加動(dòng)物血清培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明所述的添加有血液細(xì)胞的細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)基中所添加的血液細(xì)胞的細(xì)胞因子并不包括所用動(dòng)物血清中本就含有的細(xì)胞因子。

所述添加有血液細(xì)胞的細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)基可由在通用細(xì)胞培養(yǎng)基中添加血液細(xì)胞的細(xì)胞因子的方法制備獲得。

進(jìn)一步的，所述血液細(xì)胞條件培養(yǎng)基為淋巴細(xì)胞條件培養(yǎng)基。更進(jìn)一步的，為B細(xì)胞條件培養(yǎng)基或T細(xì)胞條件培養(yǎng)基。

所述添加的血液細(xì)胞的細(xì)胞因子選自以下細(xì)胞因子中的多種：GM-CSF（粒細(xì)胞集落刺激因子）、sICAM-1（人可溶性細(xì)胞間粘附分子1）；IFN gamma（γ干擾素）、IL1（白介素1）、IL-1alpha receptor（白介素1α受體）、IL1alpha（白介素1α）、IL-3（白介素3）、IL2（白介素2）、IL-10（白介素10）、IL-16（白介素16）、IL13（白介素13）、IL-17（白介素17）、IP-10（干擾素誘導(dǎo)蛋白10）、SCYA2(小誘導(dǎo)型細(xì)胞因子A2)、MIG(干擾素γ誘生單核因子)、MIP-1alpha（巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α）、TGF-beta（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β）、IL-4（白介素4）、TRAF6(TNF受體相關(guān)因子6)、FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、IGF胰島素樣生長(zhǎng)因子)、PDGF(血小板衍生生長(zhǎng)因子)、LIF(白血病抑制因子)、mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)、LPS(細(xì)胞內(nèi)毒素)、TLR1(Toll-樣受體1)、IL12（白介素12）、IL23（白介素23）、NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)、TNFalpha（α干擾素）、IL1beta（白介素1β）。