[發明專利]姜片蟲PCR-DHPLC檢測引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201310204413.7
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103266177A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 鄭秋月;曹際娟;徐楊;王剛
• 申請（專利權）人: 鄭秋月;曹際娟;徐楊;王剛
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及食品和水生植物中姜片蟲的檢測方法，尤其涉及利用PCR及變性高效液相色譜（DHPLC）技術檢測食品和水生植物中姜片蟲的方法。還涉及檢測所使用的組合物，即試劑盒。

背景技術

食品和農副產品中的有害生物主要包括細菌、病毒和寄生蟲，據世界衛生組織1999年公布的人獸共患病中，有人獸寄生蟲共患病58種，據解放軍第四軍醫大學在2004年4月-2005年2月調查我國人獸寄生蟲共患病91種。人獸共患寄生蟲病，對公共衛生、人民健康、社會安定均帶來嚴重的威脅和危害。

姜片蟲即布氏姜片蟲，屬于扁形動物門吸蟲綱復殖亞綱，是一種人獸共患的寄生蟲，是寄生在人、豬小腸內的大型吸蟲。姜片蟲中間宿主是扁卷螺，成熟尾蚴逸出螺體后，附著在水生植物或其他食品的表面形成囊蚴。人或豬因飲用含活囊蚴的生水或生食含活囊蚴的水生植物而感染。成蟲寄生于小腸，可引起姜片蟲病。當人和豬小腸內寄生的姜片蟲性成熟后，便從其生殖孔產出蟲卵，隨糞便排出體外。姜片蟲卵在自然水體中進行發育，遇到適宜的中間宿主——扁卷螺便主動鉆入螺體內，最后發育為許多尾蚴；尾蚴自螺體陸續逸出，用它的尾部擺動在水中游動，遇到水中物體，如水生植物——菱角、荸薺以及水草等，便吸附于其表面，脫落尾部，形成囊蚴。當人因生食水生蔬果，特別是用牙咬剝菱角、荸薺等的外皮時或喝生水，便可將姜片蟲囊蚴一并吞食而感染。豬也是因喂以青飼料（水花生、水浮蓮、浮萍、菱葉以及各種水草等）而感染。姜片蟲對人的致病作用，因感染程度不同而輕重不一，有的可無明顯癥狀，有的則極嚴重甚至死亡。姜片蟲病流行于亞洲。在我國以種植和有生食水生蔬果習慣及給豬喂以青飼料的地區流行較嚴重。

我國對食品中姜片蟲的檢測技術仍處于比較落后的階段，檢驗方法還只限于傳統的形態學檢測，主要是應用濃縮集卵法和顯微鏡鏡檢法，檢測水生植物等食品中的姜片蟲囊蚴，包括反復離心、反復洗滌、濃縮集卵和顯微鏡觀察的檢驗過程。檢測步驟繁瑣，方法靈敏度低；結果判斷主要依據形態學檢驗，對于檢驗人員專業能力要求高且易受主觀經驗影響。采用ELISA方法檢測寄生蟲卵，特異性差、易出現假陽性。PCR-凝膠電泳檢測方法雖然檢測成本低，但反應產物電泳處理極易造成污染；特異性強，靈敏度高的PCR方法，也存在檢測成本較高，熒光探針保存時間較短等問題。

發明內容

為了解決上述實際問題，本發明即旨在利用PCR和DHPCL技術，針對食品和水生植物中姜片蟲建立引物對，以及靈敏便捷的檢測方法，并建立應用于該方法的快速檢測試劑盒。建立可快速簡便、靈敏檢測食品和水浮蓮、浮萍、荸薺和菱角等水生植物中姜片蟲的快速檢測方法。本發明運用變性高效液相色譜（DHPLC）采用離子對反相高效液相色譜的原理，通過使用特殊的耐高溫液相色譜分離柱同時采用溫度調控的方式，對核苷酸片段分子進行分析分離。其快速高通量、全自動化操作、準確度高、重復性好及敏感性高的優點使其在核酸分析中具有無可替代的優勢。與傳統的姜片蟲檢測及鑒定方法如形態學鑒定、免疫學技術、PCR-凝膠電泳等檢測方法相比，本發明建立的方法及試劑盒，極大縮短了操作的時間，而且大大降低假陽性和假陰性結果的出現，使得結果更加準確、可靠。

本發明的技術方案為：提取樣品DNA，以DNA為模板，分別采用姜片蟲的特異性檢測引物進行PCR擴增，再用DHPLC技術采集目的基因的圖譜信息，直接從圖譜信息讀取姜片蟲的檢測結果，在此基礎上，本發明還對此方法進行了特異性和靈敏度檢測；其具體操作步驟如下：

本發明的一方面在于：提供一種姜片蟲檢測引物，具體為以下堿基序列：上游引物，SEQ?ID?NO.1；下游引物，SEQ?ID?NO.2。

本發明的另一方面在于：提供一種姜片蟲檢測試劑盒，其包括上文所述的引物SEQ?ID?NO.1～2。

對于上述技術方案中所述的姜片蟲檢測試劑盒，包括濃度為5?U/μL的Taq?DNA聚合酶和PCR反應液；分別獨立包裝；其中，所述的PCR反應液為混合液，其中含上文所述引物SEQ?ID?NO.1～2各10μM之外，還包括10mM?Tris·HCl、50?mM?KCl、25?mM?MgCl₂、dNTP?各2.5?mM。

本發明的另一方面在于：提供一種食品和水生植物中姜片蟲的檢測方法，其利用上述技術方案中所述的姜片蟲引物檢測試劑盒，對樣品DNA進行PCR方法檢測。

對于上述技術方案中所述的食品和水生植物中姜片蟲的檢測方法，其包括以下操作步驟：分別對樣品按下述方法進行PCR檢測：

①PCR反應體系為25μL，其中：