[發明專利]用于Smad3靶基因相關miRNA的回收和鑒定的探針、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201310202597.3
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103320432A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 蘇小平;曹雪濤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶家蓉

1.一種核酸探針，其特征在于，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO:26。

2.一種包含權利要求1所述的核酸探針的用于分離和/或鑒定miRNA的試劑盒或套盒，其中所述miRNA能與細胞中特定的靶基因mRNA特異性結合，所述靶基因是Smad3基因，所述試劑盒或套盒中還包含：

(i)細胞交聯試劑；

(ii)RNA提取試劑；

(iii)解交聯劑；

(iv)核酸探針偶聯物回收試劑；

(v)miRNA分離和/或鑒定試劑。

3.一種從細胞中回收和/或鑒定miRNA，用于靶基因mRNA的檢測的方法，所述靶基因是Smad3基因mRNA，其中所述miRNA能與細胞中所述靶基因mRNA特異性結合，其特征在于，所述方法包括：

(a)使得權利要求1所述的核酸探針進入細胞并與所述靶基因mRNA結合；

(b)對所述細胞進行交聯，以使得連接有所述核酸探針的所述靶基因mRNA和與之特異性結合的miRNA保持結合狀態；

(c)從所述細胞中回收核酸探針-靶基因mRNA結合物、核酸探針-靶基因mRNA-miRNA結合物；

(d)對步驟(c)的回收產物進行解交聯；

(e)分離和/或鑒定與所述靶基因mRNA特異性結合的miRNA。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸探針進入細胞是通過電刺激、化學方法或機械方法實現的，優選化學刺激法、脂質體介導法、電擊法、電穿孔、激光致孔或DEAE一葡聚糖介導，更優選脂質體介導法。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述交聯的方式選自：紫外線交聯、多聚甲醛交聯或它們的組合，優選多聚甲醛交聯。

6.如權利要求3所述的方法，在步驟(b)和(c)之間還包括破碎細胞。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述破碎細胞是通過選自下組的方式進行的：用細胞裂解液裂解、超聲波破碎、研磨破碎，優選超聲波破碎方式。

8.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(c)中的所述回收是通過親和吸附或親和層析進行的，所用載體選自：交聯瓊脂糖凝膠、交聯磁珠，優選交聯磁珠。

9.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述解交聯是通過選自下組的一種或多種方式進行的：用蛋白酶K處理、30～90℃處理、或它們的組合，優選65℃處理。

10.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述miRNA的分離和/或鑒定采用選自下組中的一種或多種方式進行：miRNA芯片檢測、miRNA定量PCR檢測、miRNA定量PCR芯片檢測或miRNA大規模測序，優選miRNA定量PCR芯片檢測。