[發明專利]一種抗黑條矮縮病載體及抗黑條矮縮病轉基因水稻培育

有效

• 申請號: 201310202564.9
• 申請日: 2013-05-28
• 公開（公告）號: CN103276006A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 左示敏;潘學彪;張亞芳;陳宗祥;吳林波;薛文霞
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種抗水稻黑條矮縮病的專用載體。

背景技術

水稻黑條矮縮病RBSDV病是一種主要由灰飛虱作為蟲媒傳播的病毒病，近年來，該病害在江蘇、浙江等長江中下游稻區猖獗流行，造成了巨大經濟損失。培育抗病品種是控制病害流行的最經濟有效的方法，但是迄今未發現優異的抗病種質或抗病基因資源，使得依靠傳統技術的抗黑條矮縮病育種無法開展。

近20年來，人類對付病毒危害的最主要方法就是轉基因技術。自從Powell等將病毒外殼蛋白基因在轉基因煙草中表達而使煙草獲得一定程度的抗TMV病毒侵染以來，大量的病毒基因及其片段都被證明可以誘導植物對相應病毒產生有效抗性的基因。該轉基因方法的主要過程是，將病毒的外殼蛋白等基因進行克隆和重組，然后轉入植物細胞內，使得轉基因植株獲得抗病毒的能力，但至今仍不清楚該方法使得植株產生抗性的分子機制。上世紀末，RNA干擾RNAi技術的出現及隨后的發展，為人類控制植物病毒病提供了一種高效方便的方法。目前利用RNAi技術控制植物病毒病的最主要技術過程是，在宿主植物體內表達基于病毒基因組序列為靶位點設計的RNAi片段，利用該片段在宿主體內表達以沉默入侵病毒基因組中的特定基因表達，從而影響病毒復制，使得宿主產生抗性。與以往技術相比，RNAi技術產生的抗病毒效應具有高度特異性，對非同源基因表達幾乎沒有影響，且產生的抗病毒效果好。目前，該技術已被普遍應用于植物抗病毒轉基因研究中。

Wang等（2000）以大麥黃矮病毒的復制酶為目的靶基因位點構建RNAi載體并轉化大麥，獲得了抗黃矮病的轉基因大麥。馬中良（2004）等根據水稻矮縮病毒RDV序列，構建了與其相關的RNAi載體并轉化水稻，獲得了對水稻矮縮病毒抗性有所提高的轉基因水稻。鐘環（2006）以病毒基因組中的SP基因和CP基因為靶標，分別構建了RNAi載體，轉入不同水稻品種中均成功的提高了水稻對條紋葉枯病的抗性。然而，大量的研究還發現，針對病毒的不同基因或同一基因的不同靶位點設計產生的RNAi片段，轉入宿主植物后所產生的干擾效果，彼此間差異明顯。這就要求，在針對具體的病毒RNAi轉基因研究中，需要篩選到合適的RNAi片段，以達到最好的抗病毒病效果。

水稻黑條矮縮病毒的基因組由10條線性的雙鏈RNA即dsRNA組成，根據其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移距離，由小到大分別命名為S1-S10。研究結果表明RBSDV的基因組全長為29141bp，至少含有13個開放閱讀框?ORF，除了S5、S7和S9均含有2個順反子之外，其余7個基因組片段均為單順反子。

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發明內容

本發明的目的在于提供一種包含特定RNAi片段的可有效控制水稻黑條矮縮病的專用載體，并應用該載體培育抗黑條矮縮病轉基因水稻，為通過轉基因技術培育抗黑條矮縮病水稻新品種提供基因資源。

為了解決以上技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種抗黑條矮縮病載體p1301/Ubi-S6RNAi，包括常用的植物RNAi載體p1301/Ubi-RNAi的基本骨架和轉移T-DNA區，其特征在于在轉移T-DNA區中增加了S6RNAi片段，其具體由S6(1)、內含子和S6(2)共三個片段串聯組成。

所述的S6(1)片段是通過特異PCR引物擴增黑條矮縮病病毒侵染稻株的cDNA所得，特異PCR引物S6F序列為5’?CGGGATCCCTCGAATC?ATCCGTCACTTCTGAGT?3'，S6R序列為5’?GGACTAGTGGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG?3'；S6(1)片段序列為ctcgaatcatccgtcacttctgagtGttctaattcgaaaaaacgctacgcacgtccatctaacaaaActtctcctcaacctaactcttcTgaatcatcCaatgaAactaaactgcGtcaGaatttgatttcttctgcttcaaattcctccgtggtgatgaaacctaattcagacgtactcaacctgtcCaaaactcaaactatccttccttctttagttgtgaatgccacttgccagCtacgaatgaaaaatctcgataattggaaaggttttgtccActAgtc。