[發(fā)明專(zhuān)利]苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因pudmA及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310202122.4
• 申請(qǐng)日: 2013-05-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103266117A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李順鵬;閆新;谷濤;何健;洪青;蔣建東;黃星;孫紀(jì)全
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/53
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/53;C12N9/02;C12N15/63;C12N1/21;A01H5/00;A62D3/02;C02F3/00;B09C1/10;C12R1/19;A62D101/04;A62D101/28
• 代理公司: 南京天華專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于應(yīng)用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，涉及苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因pudmA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治、清除雜草以及控制人畜傳染病等方面發(fā)揮了巨大的作用，但是同時(shí)也帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，農(nóng)藥污染直接導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥超標(biāo)，產(chǎn)品品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響了我國(guó)農(nóng)副產(chǎn)品的出口；另一方面，環(huán)境中殘留農(nóng)藥通過(guò)各種途徑，主要是食物鏈富集，最終直接威脅到人類(lèi)的生命健康；此外，農(nóng)藥殘留還間接導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)改變、功能破壞。

異丙隆和綠麥隆等苯基脲（或稱(chēng)取代脲）類(lèi)除草劑（phenylurea?herbicides）是根據(jù)在脲分子中氨基上的取代基和在苯環(huán)上取代基不同而合成一系列除草劑，它們主要是通過(guò)抑制光合作用起到除草的效果，大多數(shù)取代脲類(lèi)除草劑主要作苗前土壤處理劑，防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草，雖然此類(lèi)除草劑被作為一種低毒除草劑在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，但是其大量使用而造成的一系列環(huán)境問(wèn)題已經(jīng)引起人們的重視，如異丙隆等苯基脲類(lèi)除草劑在環(huán)境中的殘留對(duì)水生無(wú)脊椎動(dòng)物、藻類(lèi)以及微生物的活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生不良影響，而且異丙隆是一種致癌物。因此對(duì)其殘留的微生物降解機(jī)理及其基因在修復(fù)中的應(yīng)用的研究成為了熱點(diǎn)。

微生物修復(fù)技術(shù)具有高效、綠色、成本低廉、無(wú)二次污染等特點(diǎn)，受到環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛關(guān)注，應(yīng)用前景十分廣闊。微生物降解修復(fù)農(nóng)藥的本質(zhì)是微生物產(chǎn)生的酶對(duì)農(nóng)藥的降解作用，從微生物中提取的降解酶系來(lái)消除農(nóng)藥殘留在國(guó)外已有成功的先例，降解酶的來(lái)源可以通過(guò)從降解菌中提取，也可以采用基因工程手段構(gòu)建高效表達(dá)菌株來(lái)獲得。苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因的獲得在該類(lèi)除草劑污染的修復(fù)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。同時(shí)可通過(guò)基因改造擴(kuò)大脫甲基的作用底物范圍和作用強(qiáng)度，廣泛應(yīng)用于環(huán)境中苯基脲類(lèi)除草劑的降解，保護(hù)環(huán)境。另外構(gòu)建和種植抗除草劑轉(zhuǎn)基因是解決除草劑藥害的最佳途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因，該基因可用于構(gòu)建抗苯基脲類(lèi)除草劑的轉(zhuǎn)基因作物，也可用于土壤、水體中苯基脲類(lèi)除草劑殘留的去除。

本發(fā)明的另一目的是提供該基因的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因pudmA，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。

本專(zhuān)利所用的出發(fā)菌株為一株能夠降解苯基脲類(lèi)除草劑的細(xì)菌菌株YBL3（CCTCC?NO:M208076）在分類(lèi)上屬于鞘氨醇桿菌（Sphingobium?sp），質(zhì)譜分析結(jié)果表明菌株YBL3可以把異丙隆等苯基脲類(lèi)除草劑的N-甲基脫除，使其失去除草活性。

苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因pudmA采取的策略為轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。雖然轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變法隨機(jī)性較差，在實(shí)際應(yīng)用中效率很低，但如果在基因組序列已知的情況下，該方法的效率就會(huì)大大提高。YBL3（CCTCC?NO:M208076）能在無(wú)機(jī)鹽平板上利用異丙隆等苯基脲類(lèi)除草劑為唯一碳氮源生長(zhǎng)，通過(guò)三親接合利用質(zhì)粒pSC123(見(jiàn)圖1)將轉(zhuǎn)座子mini-Tn5隨機(jī)插入YBL3基因組后，將在LB加抗生素平板上長(zhǎng)出的菌落分別點(diǎn)于無(wú)機(jī)鹽加異丙隆平板和無(wú)機(jī)鹽加葡萄糖及硫酸銨平板，前者用來(lái)篩選不能以異丙隆為碳氮源生長(zhǎng)的菌株，后者用來(lái)排除那些隨機(jī)插入產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，利用本課題組發(fā)明的SEFA-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增出突變子的上游序列，通過(guò)和基因組序列比對(duì)鎖定mini-Tn5的插入位點(diǎn)，然后再分析驗(yàn)證是否失活了異丙隆降解過(guò)程中的某步基因。

用上面的策略篩選到一株不能在無(wú)機(jī)鹽加農(nóng)藥的平板上生長(zhǎng)但可以在LB平板上正常生長(zhǎng)的突變株，進(jìn)一步的降解實(shí)驗(yàn)表明該突變子不能降解異丙隆。設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行SEFA-PCR，多次PCR測(cè)序后，拼接結(jié)果表明插入位點(diǎn)為雙加氧酶基因的β亞基，該基因包含兩個(gè)亞基，全長(zhǎng)為1907bp（其中α亞基長(zhǎng)度為1380bp，編碼459個(gè)氨基酸；β亞基長(zhǎng)度為531bp，編碼176個(gè)氨基酸），命名為pudmA。這是首個(gè)報(bào)道的苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因。

所述的苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因pudmA核苷酸序列所編碼的苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因蛋白PudmA，其氨基酸序列為：SEQ?ID?NO.2。

含有所述的苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因pudmA的重組表達(dá)載體。

所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選將所述的苯基脲類(lèi)除草劑N-脫甲基酶基因pudmA插入pET-29a(+)的NdeI和EcoRI位點(diǎn)之間所得。